Eine der faszinierendsten Fragen der Biologie ist, wie in vielzelligen Organismen Gene angeschaltet werden. Wie man inzwischen weiß, müssen sich dazu mehrere Proteine, die Transkriptionsfaktoren, an einen speziellen Abschnitt für das abzulesende Gen heften. Das richtige Ensemble bildet eine Art Ein-Schalter an der Erbsubstanz DNA, der ein Abschreiben der genetischen Information – die Transkription – ermöglicht. (Es gibt freilich auch Faktoren, die als Aus-Schalter fungieren.) Rätselhaft blieb aber, wie ein Transkriptionsfaktor seine spezielle Bindungsstelle innerhalb der Unmenge von DNA in der Zelle ausmachen kann.

Antworten beginnen sich jetzt abzuzeichnen. Viele Transkriptionsfaktoren haben sich als ausgesprochene Spürnasen erwiesen: Ihre Aminosäurekette ist so gefaltet, daß sich mehrere – wegen ihrer Funktion und eines formbestimmenden Zink-Ions – als Zinkfinger bezeichnete Vorsprünge ergeben, die sich bestens für die Erkennung von DNA eignen.

Entdeckt hat diese Strukturen unsere Gruppe am Molekularbiologischen Laboratorium des britischen Medizinischen Forschungsrates in Cambridge 1985, und zwar an einem Transkriptionsfaktor eines Froschs. Seither wurden bei mehr als 200 Proteinen, darunter vielen Transkriptionsfaktoren, derartige Zinkfinger nachgewiesen. Zudem fanden sich verwandte Strukturen bei verschiedenen anderen Transkriptionsfaktoren. In letzter Zeit haben nun einige Laboratorien – darunter unseres – auch mehr darüber herausbekommen, wie Zinkfinger und verwandte Proteinstrukturen ihre spezielle Bindungsstelle auf der DNA zu erkennen und dann regelrecht zu ergreifen vermögen.

Sie sind freilich nicht die einzigen Strukturen für solche Interaktionen von Transkriptionsfaktoren mit der DNA. Weitere wichtige Beispiele sind das Helix-Knick-Helix-Motiv (bereits 1981 entdeckt), die Homöodomäne und der Leucin-Reißverschluß (siehe „Molekulare Reißverschlüsse bei der Genregulation“ von Steven Lanier McKnight, Spektrum der Wissenschaft, Juni 1991, Seite 55, sowie „Intelligente Gene“ von Tim Beardsley, Spektrum der Wissenschaft, Oktober 1991, Seite 64). Der Zinkfinger ist jedoch das bei weitem häufigste DNA-bindende Strukturmotiv.

Letztlich sollte man mit der Erforschung der DNA-Erkennung auch der Lösung der umfassenderen Frage näherkommen, wie aus einem befruchteten Ei ein vielzelliger Organismus entsteht. Obwohl alle Zellen des sich entwickelnden Embryos dieselben Gene tragen, werden manche zu Neuronen (Nervenzellen), andere etwa zu Hautzellen. Je nach ihrer Bestimmung werden während der Embryonalentwicklung unterschiedliche Kombinationen von Genen angeschaltet – für eben jene Proteine, die den ausdifferenzierten Zellen ihre charakteristischen Eigenheiten verleihen. Um diese selektive Genaktivierung zu verstehen, muß man wissen, wie Transkriptionsfaktoren ihre speziellen DNA-Bindungsstellen erkennen.

Die Entdeckung

Auf die Spur der Zinkfinger brachten uns Ergebnisse aus den Laboratorien von Robert G. Roeder, der damals an der Washington-Universität in Saint Louis (Missouri) arbeitete, und Donald D. Brown von der Carnegie-Institution von Washington in Baltimore (Maryland). Um 1980 hatten beide Gruppen erstmals bei einem höheren Organismus als einem Bakterium die Schritte herausgearbeitet, über die ein bestimmtes, nicht für ein Protein codierendes Gen in RNA transkribiert wird. So hatten sie beim südafrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) festgestellt, daß mindestens drei Faktoren nötig sind, um das Gen für die 5S-RNA zu aktivieren (diese ist ein Bestandteil der Ribosomen, der Proteinfabriken der Zelle). Einer davon, der Transkriptionsfaktor IIIA, kurz TFIIIA, dockte an ein relativ langes Stück DNA an, das etwa 45 Basenpaare umfaßte. (Die Basenpaare entsprechen den Sprossen der wie eine gewendelte Strickleiter aussehenden DNA-Doppelhelix; in ihrer Abfolge ist die genetische Information verschlüsselt; Bild 1.)

Die Länge der Bindungsregion überraschte uns, weil der Faktor selbst ziemlich klein ist. Bei Transkriptionsfaktoren ähnlicher Größe, die man einige Zeit zuvor bei Bakterien identifiziert hatte, betrug sie nur etwa ein Drittel. Wie konnte das TFIIIA-Molekül dennoch einen so ausgedehnten DNA-Bereich überspannen?

Dies zu erkunden schien glücklicherweise nicht abschreckend mühsam. Transkriptionsfaktoren werden gewöhnlich nur in Spuren produziert, von TFIIIA aber gibt es in den unreifen Eizellen von Fröschen einen Speichervorrat; er liegt dort als Komplex mit der 5S-RNA vor, an deren Erzeugung er beteiligt ist. Darum waren wir zuversichtlich, so viel von dem Komplex gewinnen zu können, daß sich daraus das Protein für die eigentlichen Untersuchungen isolieren ließ. Das Projekt lief dann zwar weniger glatt als gedacht, aber das gleich zu Anfang auftauchende Problem eröffnete direkt den Weg zur Entdeckung der Zinkfinger.

Zunächst versuchte Jonathan Miller, der 1982 als Forschungsstudent in unserem Labor arbeitete, mit einem bekannten Verfahren den Komplex zu extrahieren. Die Ausbeute war jedoch enttäuschend. Wie sich herausstellte, wurden durch die verwendete Methode Metall-Ionen entfernt, die für den Zusammenhalt des Komplexes unentbehrlich waren. Nachdem Miller die Extraktionsmethode entsprechend verändert und eine hinreichende Menge des Komplexes gewonnen hatte, konnte er das Metall als Zink identifizieren; und zwar enthielt jede Einheit aus TFIIIA und 5S-RNA zwischen sieben und elf Zink-Ionen, ungewöhnlich viele also.

In weiteren Experimenten zerlegten wir TFIIIA mit einem proteinspaltenden Enzym in immer kleinere Stücke. Dabei schrumpfte jedes Fragment in Schritten von rund 3000 Dalton, bis am Ende nur noch Unterfragmente dieser Größe vorlagen (Dalton ist die Maßeinheit des Molekulargewichts). Sie widerstanden dem weiteren enzymatischen Angriff, vermutlich weil sie kompakt gefaltet waren.

All dies legte nahe, daß TFIIIA fast gänzlich aus hintereinandergeschalteten Abschnitten von jeweils drei Kilodalton besteht und daß jeder dieser Bereiche von etwa 30 Aminosäuren Länge um ein Zink-Ion zu einer kleinen kompakten DNA-bindenden Domäne gefaltet ist. Wenn diese Annahme stimmte, waren wir auf eine neue Art Transkriptionsfaktor gestoßen. Alle anderen, die man bis dahin ähnlich detailliert untersucht hatte, lagerten sich paarweise – also als Dimere – an der DNA an, wobei jedes Einzelprotein zu ihr über nur ein Bindungsmotiv Kontakt herstellte. Unsere Befunde bedeuteten, daß TFIIIA sich längs der Doppelhelix erstrecken und mit ihr an mehreren Punkten – statt nur an einem – Kontakt haben sollte.

Während wir überlegten, wie unser Modell zu beweisen sei, publizierte Roeders Gruppe die Aminosäuresequenz von TFIIIA, und die stützte unsere Vorstellung: Neun ähnliche Einheiten zu je rund 30 Aminosäuren bildeten aneinandergereiht die ersten drei Viertel der linearen Kette. Mehr noch, alle enthielten je ein Paar der Aminosäuren Cystein und Histidin in nahezu identischen Positionen (siehe untere Bildhälfte im Kasten auf Seite 566). Und dies wieder- um stimmte mit unserem Modell überein, wonach jede Einheit ein eigenes Zink-Ion enthält; Zink ist nämlich in Proteinen im allgemeinen an vier Aminosäuren gebunden, oft an vier Cysteine oder eine Kombination aus Cysteinen und Histidinen.

Daraufhin veröffentlichte einer von uns (Klug) 1985 als Strukturvorschlag, die unveränderlichen Histidine und Cysteine veranlaßten jede Einheit, sich unabhängig von den anderen zu einer DNA-bindenden Mini-Domäne zu falten. Und zwar sollten das Cystein-Paar dicht am Anfang und das Histidin-Paar am Ende dasselbe Zink-Ion in einer Weise binden, daß der dazwischenliegende Abschnitt sich zu einer Schleife ausstülpt. Von den rund 30 Aminosäuren einer Einheit würden sich demnach 25 zu einer strukturierten Domäne falten – eben jener, die später Zinkfinger genannt wurde, weil sie dazu dient, die DNA-Doppelhelix zu ergreifen. Die restlichen müßten sozusagen als Verbindungssehne zwischen aufeinanderfolgenden Fingern fungieren (siehe obere Bildhälfte im Kasten Seite 56).

Kombinationsfähige Module

Kurz darauf bewiesen Messungen in Zusammenarbeit mit Gregory P. Diakun vom Laboratorium des britischen Forschungsrates für Wissenschaft und Technik in Daresbury bei Manchester, daß tatsächlich jede der neun Einheiten ein Zink-Ion in der vorgeschlagenen Bindungskonstellation enthält. TFIIIA war demnach in der Hauptsache eine Reihung von neun Zinkfingern. Alle zeigten denselben Grundbauplan, waren aber chemisch unterscheidbar, weil sie in ih-ren nicht am Grundgerüst des Moduls beteiligten Aminosäuren voneinander abwichen.

Stimmte nun auch unsere Annahme, daß jeder für sich Kontakt mit der DNA aufnimmt? Um das herauszufinden, benutzten Louise Fairall in unserer Gruppe sowie andere Wissenschaftler die sogenannte Fußabdruck-Methode (nach dem englischen Begriff dafür als Footprinting bezeichnet). Dazu läßt man das interessierende Protein sich an die DNA binden und wendet anschließend Enzyme oder andere Agenzien an, die das Rückgrat der DNA-Stränge spalten. Davon verschont bleiben dann nur die Stellen, an die sich Teile des Proteins geheftet haben. Wie vermutet, hatte TFIIIA Mehrfachkontakt zur DNA. Mit seinen aneinandergereihten unabhängigen DNA-Bindungsmodulen repräsentierte das Molekül einen neuartigen Typ von Transkriptionsfaktor.

Die Modulbauweise ist ausgesprochen ökonomisch. Wie man damals bereits wußte, erhalten Zellen ein umfangreiches Repertoire von Genschaltern schon allein dadurch, daß sie eine begrenzte Zahl von Transkriptionsfaktoren auf alle möglichen Arten miteinander kombinieren. Das heißt, ein Gen kann etwa durch die Kombination der Faktoren a, b und c aktiviert werden, ein anderes Gen durch a und b und wieder ein anderes durch a, b und d. Somit muß nicht für jedes der vielen aktiven Gene einer Zelle ein eigener Transkriptionsfaktor hergestellt werden (der dann wiederum von einem eigenen Gen codiert sein müßte).

Wie die Zinkfinger-Studien enthüllten, kann das kombinatorische Prinzip auch innerhalb eines Transkriptionsfaktors verwirklicht sein. Eine Zelle vermag eine umfassende Kollektion unterscheidbarer Faktoren hervorzubringen, indem sie Auswahl, Anordnung und Zahl der unabhängigen DNA-bindenden Module im Molekül variiert. Die spezielle Kombination von Zinkfingern in einem Faktor bestimmt dann, welche DNA-Sequenz er erkennt.

Weil eine solche Kombinatorik für Organismen sehr ökonomisch ist, vermuteten wir, daß das Zinkfinger-Motiv bei vielen Proteinen zu finden sein würde. Doch das tatsächliche Ausmaß seines Vorkommens bei Eukaryonten, bei allen über den Bakterien stehenden Organismen, ist verblüffend. Nach Schätzungen von Peter F.R. Little vom Imperial-College in London codiert allein 1 Prozent der menschlichen DNA für Zinkfinger; bei Chromosom 19 liegt der Anteil sogar bei 8 Prozent. Die bislang identifizierten Zinkfinger-Proteine enthalten zwischen zwei und 37 ihrer namensgebenden Strukturen hintereinander.

Die Architektur

Wie erkennt nun ein Zinkfinger eine spezielle Abfolge von Basenpaaren, die ja eine bestimmte räumliche Anordnung im DNA-Molekül haben? Um das zu verstehen, muß man wiederum den genauen räumlichen Aufbau des Fingermoduls kennen. Bei den meisten Proteinen gibt es lokale Bereiche, in denen das gefaltete Rückgrat der Aminosäurekette eine charakteristische Sekundärstruktur aufweist (die Aminosäuresequenz selbst nennt man Primärstruktur). Die verbreitetsten Sekundärstruktur-Elemente sind die Alpha-Helix – dort ist das Rückgrat schraubig gewunden – und der Beta-Strang; in ihm ist die Kette gestreckt (Spektrum der Wissenschaft, März 1991, Seite 72).

Jeremy M. Berg von der Johns-Hopkins-Universität in Baltimore hat die entscheidenden Merkmale der dreidimensionalen Finger-Architektur 1988 auf theoretischer Grundlage herausgearbeitet. Sein Modell wurde aber erst 1989 bestätigt, als Peter E. Wright und seine Mitarbeiter an der Scripps-Klinik und Forschungsstiftung in La Jolla (Kalifornien) direkt die Struktur eines Zinkfingers aus einem Xenopus-Protein namens Xfin bestimmten. Ermittelt wurde sie durch Kernresonanz-Spektroskopie, kurz NMR-Spektroskopie (nach englisch nuclear magnetic resonance). Mit ihr lassen sich kleine Proteine in Lösung untersuchen (man braucht also nicht wie für eine Röntgen-Strukturanalyse erst hinreichend große Proteinkristalle zu erzeugen). Wenig später stellten unsere und andere Arbeitsgruppen dieselbe Bauweise auch bei weiteren Zinkfinger-Proteinen fest.

Wie Berg vorausgesagt hatte, faltet sich die erste Hälfte der charakteristischen Fingersequenz (die für eine Flanke des Fingers) zu einem kleinen Beta-Faltblatt, indem sich Beta-Strangabschnitte haarnadelförmig aneinanderlegen (Bild 2 links). Die zweite Hälfte der Sequenz (die für die andere Flanke) verwindet sich zu einer Alpha-Helix. Die beiden Cysteine sitzen am Fuß des Beta-Faltblatts, die beiden Histidine am Fuß der Helix. Alle vier Aminosäuren sind über ein Zink-Ion miteinander gekoppelt, das auf diese Weise beide Flanken regelrecht zusammenheftet.

Die NMR-Analyse half auch, die Rolle einiger weiterer Aminosäuren zu klären. Bereits bei der ersten Durchmusterung der TFIIIA-Sequenz waren uns bei den hypothetischen Fingern je drei hydrophobe Aminosäuren in nahezu identischen Positionen aufgefallen. (Hydrophobe, also wassermeidende Aminosäuren lagern sich bevorzugt mit ihresgleichen im Innern von Proteinen zusammen, wo sie nicht dem meist wäßrigen Milieu der Umgebung ausgesetzt sind.) Dies sprach für eine strukturell bedeutsame Rolle dieser Bausteine. Sie liegen zwar in der linearen Abfolge recht weit auseinander, doch war durchaus denkbar, daß sie im dreidimensionalen Molekül irgendwie miteinander wechselwirken und so zur Faltung der Mini-Domäne beitragen. Wie dann die NMR-Ergebnisse im Einklang mit dem Bergschen Modell zeigten, kommen bei der Faltung des Zinkfinger-Moduls die hydrophoben Aminosäuren einander tatsächlich so nahe, daß ihre gegenseitige Anziehung wirksam werden kann: Sie bilden zusammen einen hydrophoben Kernbereich, der dem Modul seine Form bewahren hilft.

Getrennte Leseköpfe

Parallel zu unseren Bemühungen, die Architektur der Zinkfinger zu verstehen, versuchten wir und andere ein allgemeineres Problem zu lösen. Aus vielen Experimenten war zu schließen, daß die Zinkfinger des TFIIIA, die ja seinen überwiegenden Teil ausmachen, allein für sein Erkennungsvermögen verantwortlich sind; doch wurden mehr und mehr große Proteine entdeckt, die nur einige wenige Zinkfinger enthielten. Konnten diese vergleichsweise kurzen Zinkfinger-Bereiche ihre Proteine ohne Mitwirkung anderer Teile zu den richtigen Promotoren lotsen? (An diese DNA-Abschnitte müssen die Transkriptionsfaktoren andocken, um dem abschreibenden Enzym sozusagen Ankerhilfe zu geben.) Wir haben dies in erster Linie an einem dreifingrigen Transkriptionsfaktor der Hefe zu klären versucht, der SWITCH5 (wörtlich: Schalter 5; SWI5) genannt wird.

Mit unserem Kollegen Kyoshi Nagai isolierten wir die Region, welche die Finger enthält; sie band sich so begierig an den Promotorabschnitt des zugehörigen Zielgens, daß wohl die Zinkfinger allein für die DNA-Bindung verantwortlich sind. Interessanterweise mußten mindestens zwei Finger hintereinander vorhanden sein, damit sich das SWI5-Protein hinreichend fest an die richtige Zielstelle auf der DNA binden konnte. Gemeinsame NMR-Untersuchungen mit unseren Kollegen David Neuhaus und Yukinobu Nakeseko an den zwei ersten Zinkfinger-Motiven von SWI5 bestätigten, daß benachbarte Zinkfinger sich nicht zu einer gemeinsamen Struktur zusammenschließen: Sie sind vollkommen unabhängige Leseköpfe, gekoppelt durch flexible Zwischenstücke.

Die genauen Berührungspunkte zwischen Zinkfingern und DNA mußten jedoch noch identifiziert werden. Der erste Durchbruch gelang 1991 an Zif268, einem Transkriptionsfaktor mit ebenfalls drei Zinkfingern hintereinander, der während der Frühentwicklung von Mäusen wirksam ist. Nikola P. Pavletich und Carl O. Pabo konnten damals an der Johns-Hopkins-Universität Kristalle von dem Komplex aus DNA und DNA-bindender Domäne des Faktors für eine Röntgenstrukturanalyse herstellen. Sie ergab, daß die Zinkfinger-Region von Zif268 fast eine volle Windung der DNA-Helix umschlingt und sich dabei in deren große Furche einschmiegt (diese ist die breitere der beiden parallel verlaufenden Rillen, die sich wie bei einem Schraubengewinde um die Längsachse der DNA-Doppelhelix winden; Bild 2 rechts). Die Zinkfinger treten mit aufeinanderfolgenden, je drei Basenpaare langen Stellen der DNA in Kontakt; ihre Alpha-Helix weist zur großen Furche, deren eine Seitenwand sie berührt.

Der erste und der dritte Finger von Zif268 heften sich nun, wie sich im einzelnen ergab, in genau gleicher Weise an die DNA: Eine Aminosäure in der ersten Windung der Alpha-Helix stellt Kontakt zum ersten Basenpaar der zugehörigen Bindungsstelle auf der DNA her und eine Aminosäure aus der dritten Windung zum dritten Basenpaar derselben Bindungsstelle. Bei dem zweiten Finger sind es hingegen je eine Aminosäure der ersten und zweiten Windung, die dann mit dem ersten beziehungsweise zweiten Basenpaar der Bindungsstelle Kontakt aufnehmen. Zusätzlich heften sich sowohl die Alpha-Helix als auch das Beta-Faltblatt der Finger an Phosphatgruppen im Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA-Stränge (die Rückgrate bilden die Holme der gewendelten DNA-Leiter). Diese Bindungen sorgen für eine stabilere Verankerung der Zinkfinger an der Erbsubstanz.

Seither hat man noch von keinem anderen derartigen Komplex die Struktur röntgenkristallographisch klären können. Immerhin fand Grant H. Jacobs in unserem Labor einen guten Hinweis darauf, daß viele Zinkfinger sich in sehr ähnlicher Weise wie die von Zif268 an die DNA binden: Bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen von mehr als 1000 Zinkfinger-Motiven erwiesen sich die Aminosäuren in drei Positionen als besonders variabel – und sie entsprechen exakt jenen in der ersten, zweiten und dritten Windung der Alpha-Helix von Zif268, die für Kontakt zur Erbsubstanz sorgen.

Hier tut sich eine interessante Perspektive auf. Vielleicht lassen sich Zinkfinger-Module einmal maßgeschneidert herstellen, so daß sie jeweils gewünschte DNA-Sequenzen erkennen. Solche molekularen Werkzeuge könnten sowohl für die Erforschung der Genregulation als auch für medizinische Zwecke bedeutsam sein.

Freilich sind die Erkenntnisse aus dem Zif268-Modell und den statistischen Analysen nicht beliebig übertragbar. So dürften Proteine mit vielen Zinkfingern etwas anders mit der DNA interagieren. Träfe zum Beispiel das Bindungsschema von Zif268 auch auf TFIIIA zu, müßte dieses Protein mit seinen neun Zinkfingern sich über drei Windungen in der großen Furche um die DNA herumschlingen. Man kann sich gut vorstellen, wie hinderlich eine solche Dreifachwicklung wäre, wenn der Faktor sich wieder lösen soll. Tatsächlich legen unsere und andere Footprint-Ergebnisse nahe, daß TFIIIA nicht wie ein Faden auf die DNA aufgespult ist. Seine ersten drei Finger, das ist nahezu sicher, umklammern eine einzelne Windung der DNA, und seine letzten drei Finger tun sehr wahrscheinlich dasselbe. Da aber der Hauptteil des Proteinmoleküls nur auf einer Seite der Doppelhelix liegt, muß es die kleine Furche (sie verläuft parallel zur großen) mindestens zweimal kreuzen. Das abweichende DNA-Bindungsmuster einzelner Bereiche spiegelt vermutlich den Umstand wider, daß sich beim TFIIIA die Aminosäuresequenzen der Finger stärker voneinander unterscheiden als bei Proteinen, die Zif268 ähnlich sind.

Entwicklungsgeschichtlich gibt es gute Gründe anzunehmen, daß vielfingrige DNA-bindende Domänen durch mehrfache Verdoppelung eines urtümlichen Gens entstanden sind, das für ein kleines Protein aus etwa 30 Aminosäuren codierte. Wir glauben ferner, daß diese Kette aus 30 Aminosäuren einer der frühesten von der Evolution hervorgebrachten Eiweißstoffe sein könnte. Zum einen wäre ein solches Protein einfach zu erzeugen gewesen. Zum anderen hätte die lineare Kette, wäre sie erst synthetisiert gewesen, leicht und zielsicher Zink (das ein relativ reaktionsträges Metall ist) aus der Umgebung aufnehmen und dann ohne äußere Hilfe eine stabile räumliche Konformation annehmen können; und die Faltung hätte dem Protein die Fähigkeit verliehen, DNA oder RNA zu binden.

Solche Eigenschaften bieten sicherlich eine Erklärung dafür, warum Zinkfinger heute im gesamten Tier- und Pflanzenreich verbreitet sind. Mit jeder genetischen Bauanweisung für einen neuen sich autonom faltenden Zinkfinger hätte jede Spezies zugleich die Fähigkeit erworben, einen neuen DNA-Abschnitt zu regulatorischen Zwecken zu besetzen. Dies wiederum konnte zuvor nicht ausführbare zelluläre Funktionen ermöglichen, etwa die, ein noch stummes Gen zu transkribieren, das für ein neuartiges Enzym oder ein anderes nützliches Protein codiert.

Noch während der laufenden Forschungen an den gewissermaßen klassischen Zinkfingern zeichnete sich ab, daß das Motiv, das wir ursprünglich beim TFIIIA entdeckt hatten, nicht die einzige zink-zentrierte Struktur zur DNA-Erkennung ist.

Varianten bei Rezeptoren

Um 1987 hatte man die Aminosäuresequenzen von mehreren Mitgliedern einer großen Familie von Transkriptionsfaktoren geklärt, die als Kern-Hormonrezeptoren bezeichnet werden. Solche Faktoren können ein Gen erst aktivieren, wenn sie – je nach ihrer Funktion – spezifisch ein Steroid- oder ein Schilddrüsenhormon oder ein Vitamin gebunden haben. Alle neu ermittelten Sequenzen enthielten eine konservierte, also evolutiv kaum veränderte Domäne mit etwa 80 Aminosäuren, und in ihr gab es stets genau zwei Abschnitte mit einer Sequenz, die an den Zinkfinger erinnerte. Jeder davon enthielt zwei Paare potentiell zink-bindender Aminosäuren; anders als beim Zinkfinger aber waren es ausschließlich Cysteine. Die Ähnlichkeit zum Zinkfinger-Motiv von TFIIIA ließ darauf schließen, daß das cysteinreiche, 80 Aminosäuren umfassende Segment der Kern-Hormonrezeptoren die DNA-bindende Domäne ist.

Bestätigt haben dann diese Vermutung Pierre Chambon und Stephen Green vom französischen Nationalen Institut für Gesundheit und medizinische Forschung in Straßburg Ende der achtziger Jahre. Wenig später bewiesen Paul B. Sigler, damals noch an der Universität Chicago (Illinois), und Keith R. Yamamoto an der Universität von Kalifornien in San Francisco mit ihren Mitarbeitern, daß jeder der beiden Abschnitte der DNA-bindenden Domäne ein Zink-Ion enthält (Bild 3).

Spontan erwarteten wir und andere, daß sich ihr räumlicher Aufbau gleichen würde und daß es sich um unabhängige DNA-bindende Module handelte. Diese Annahme erwies sich aber als teilweise falsch. Zwar zeigten spätere Strukturanalysen, daß die beiden Einheiten sich ähnlich falten; doch sie fungieren nicht als unabhängige DNA-Leseköpfe, wie zuvor durchgeführte Substitutionsanalysen erwiesen hatten (dabei wird eine Aminosäure durch eine andere ersetzt und die Auswirkung auf die DNA-Bindung geprüft). So fanden Chambon, Ronald M. Evans vom Salk-Institut für Biologische Forschung in San Diego (Kalifornien) und Gordon M. Ringold von der Universität Stanford (Kalifornien) mit ihren Mitarbeitern, daß das erste Motiv die primäre DNA-Erkennungseinheit ist. Und ungefähr gleichzeitig entdeckte Evans mit seinem Mitarbeiter Kazuhiko Umesono zumindest eine Funktion für das zweite Motiv.

Um diese zu verstehen, muß man zunächst generell einiges über die Interaktionen von Steroidrezeptoren mit der DNA wissen. Solche Rezeptoren heften sich sozusagen als Zwillingspaar an die DNA, als Dimer aus zwei identischen Molekülen. Jeder Partner erkennt eine Hälfte einer zweiteiligen Bindungsstelle mit sogenannter palindromischer Sequenz: In entgegengesetzter Richtung auf den jeweils gegenüberliegenden Strangabschnitten gelesen, sind beide Sequenzhälften identisch (Bild 4). Die Bindungsstellen für verschiedene Typen von Transkriptionsfaktoren – wie den Östrogen- und den SchilddrüsenhormonRezeptor – können genau dieselbe Erkennungssequenz haben; sie unterscheiden sich dann allein in der Zahl der Basenpaare, welche die beiden palindromischen Hälften trennen.

Demzufolge muß ein Transkriptionsfaktor, um die richtige Bindungsstelle auf der DNA zu finden, auch Bereiche enthalten, die den Abstand zwischen den Hälften sozusagen messen können. Wie Evans und Umesono nun festgestellt haben, ist ein Teil des zweiten Motivs dafür zuständig.

Wie aber solche Rezeptorproteine die palindromische Sequenz erkennen, ließ sich aus all dem nicht ableiten. Nur aus dem räumlichen Aufbau ihrer DNA-bindenden Domänen würde man ersehen können, wo die funktionell wichtigen Aminosäuren dann liegen. Für den Glucocorticoid-Rezeptor der Ratte (er bindet das Hormon Cortison) klärten Robert Kaptein und seine Kollegen von der Universität Utrecht (Niederlande) 1990 NMR-spektroskopisch die Struktur der DNA-bindenden Domäne. Wenig später gelang dies in unserem Labor John W.R. Schwabe, Neuhaus und mir (Daniela Rhodes) für den menschlichen Östrogen-Rezeptor.

Vereinigte Leseköpfe

Wie aufgrund ihrer ähnlichen Aminosäurezusammensetzung zu erwarten, hatten die DNA-bindenden Domänen beider Rezeptoren weitgehend dieselbe Struktur. Jeder der beiden zinkfinger-ähnlichen Motive einer Domäne besteht aus zwei Teilen: einer unregelmäßig gewundenen Schleife anstelle des Beta-Faltblatts in klassischen Zinkfingern, gefolgt von einer Alpha-Helix (siehe Kasten auf Seite 59). Zwei Zinkbindungsstellen sitzen in der Schleife, die beiden anderen hingegen am Anfang der Helix. Aber anstatt nun getrennt zu bleiben wie die Standard-Zinkfinger, vereinigen sich die beiden Motive zu einer Struktureinheit: Darin bilden die Helices ein rechtwinkliges Kreuz. Zustande kommt diese Konstellation durch die wechselseitige Anziehung unveränderlicher sowie relativ unveränderlicher hydrophober Aminosäuren.

Nun konnten wir auch Lage und Orientierung jener drei Aminosäuren in dem ersten fingerartigen Motiv ermitteln, die nach Ergebnissen der Arbeitsgruppen von Chambon, Evans und Ringold für die DNA-Erkennung entscheidend sind. Wie sich herausstellte, sind diese Aminosäuren auf einer Flanke der Alpha-Helix angesiedelt, die deshalb von uns DNA-Erkennungshelix genannt wurde. Zugleich ließ sich aus dieser Lage auch etwas über die Funktion des zweiten Motivs sagen: Indem seine Helix die DNA-Erkennungshelix kreuzt, hält sie wie eine Stützstrebe diese am Platz. Die Aufgabenteilung zwischen den beiden Motiven legt nahe, daß das zweite zwar durch Verdoppelung aus dem ersten entstanden ist, dann aber in eine neue Rolle gedrängt wurde.

Die dreidimensionale Kartierung zeigte uns ferner, wie das zweite Motiv dafür sorgt, daß der richtige Abstand zwischen den beiden Halbstellen auf der DNA erkannt wird. Die dafür verantwortlichen Aminosäuren liegen nach Evans und Umesono zwischen den ersten beiden Cysteinen des zweiten Motivs und somit in der Schleife vor der Alpha-Helix, wo sie für das Ankoppeln des Partnermoleküls verfügbar wären. Durch computergestützte Modellierung der Wechselwirkung zwischen der DNA und den DNA-bindenden Regionen des Dimers konnte Kapteins Gruppe für den Cortison-Rezeptor feststellen, daß eine Paarbildung über diese vorhergesagten Kopplungsstellen das Dimer in die richtige Orientierung bringen würde. Seine beiden Erkennungshelices hätten dann den passenden Abstand für die zugehörigen Halbstellen der DNA. Gleiches ermittelte unsere Arbeitsgruppe für den Östrogen-Rezeptor.

Bestätigt hat sich diese Konstellation dann in Röntgenstrukturanalysen, die Sigler inzwischen an der Yale-Universität in New Haven (Connecticut) zusammen mit Yamamoto und dessen Kollegen Leonard P. Freedman durchgeführt hat (Bild 5). Anhand der Daten war überdies zu erkennen, daß jedes Molekül des Dimers zu mehreren Phosphatgruppen beiderseits der großen Furche Kontakt aufnimmt. Dadurch wird die DNA-Erkennungshelix tief in diese breite Rinne eingesenkt, so daß sie dort Bindungen mit Basenpaaren der Halbstelle einzugehen vermag.

Alles in allem zeigen die Untersuchungen an den Zinkfinger-Motiven bei der Klasse der Kern-Hormonrezeptoren, daß sie – trotz struktureller Ähnlichkeit mit den Zinkfingern vom TFIIIA-Typ – eher wie die DNA-Erkennungsmotive anderer Transkriptionsfaktoren funktionieren: etwa wie das Helix-Knick-Helix-Motiv oder der Leucin-Reißverschluß. Indem sie sich bei der Faltung zusammenlagern, statt getrennt zu bleiben, ermöglichen sie den Kern-Hormonrezeptoren, Dimere auszubilden und damit ihre spezifischen Bindungsstellen auf der DNA zu erkennen.

Defekte Zinkfinger – Ursache für Erkrankungen

So wie die Kenntnis der Struktur eines Moleküls etwas über dessen Wirkweise verrät, kann diese Information wiederum zu Einsichten in Krankheitsprozesse verhelfen. Im Falle der Zinkfinger hat man herausgefunden, daß der Wilms-Tumor, eine spezielle Form von Nierenkrebs, im Gefolge einer Mutation entsteht, durch die sich die Zinkfinger-Region eines bestimmten Proteins nicht mehr korrekt an die DNA zu heften vermag. Des weiteren lassen sich einige der Symptome, die infolge unzureichender Zink-zufuhr mit der Nahrung auftreten können, wie etwa eine Verzögerung der sexuellen Entwicklung, nunmehr der Unfähigkeit von Östrogen- und Androgen-Rezeptoren zuschreiben, in Abwesenheit von Zink die richtigen Strukturen auszubilden.

Die beiden vorgestellten Klassen von Zinkfingern unterscheiden sich grundlegend sowohl in der Struktur als auch in der Art, wie sie mit DNA wechselwirken. Wir sind überzeugt, daß die umfangreiche Familie der Zinkfinger-Proteine mit noch mehr Vielfalt aufzuwarten hat; denn die Natur ist schließlich erfinderisch.

Tatsächlich stößt man bei immer mehr Aminosäuresequenzen auf mutmaßlich zinkbindende Motive, in denen allerdings der Abstand zwischen den Cystein- und Histidin-Paaren oder die Anzahl der Paare gegenüber gängigen Zinkfingern abweicht. Ein ungewöhnliches Beispiel ist das Hefe-Protein GAL4: Es enthält sechs Cysteine, die sich um zwei Zink-Ionen falten. Wir erwarten auch, daß manche Zinkfinger oder verwandte Molekülstrukturen an anderen Aktivitäten als der Transkription beteiligt sind, etwa am Transport oder der Bearbeitung (der Prozessierung) von DNA oder sogar von RNA. Denn TFIIIA vermag sich an RNA ebensogut zu binden wie an DNA.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 4 / 1993, Seite 54
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