aktivierte Fettsäuren, Thioester aus Fettsäure und Coenzym A, besitzen als hochenergetische Verbindungen ein hohes Gruppenübertragungspotenzial. Sie werden bei der Fettsäurebiosynthese oder bei der Aktivierung freier Fettsäuren gebildet. Die Acyl-CoA-Synthetasen katalysieren die Bildung der CoA-Derivate gemäß folgender Reaktion: CH₃(CH₂)_nCOOH + ATP + HS-CoA

CH₃(CH₂)_nCO~SCoA + AMP + PP_i + H₂O. Die Reaktion verläuft über das Adenylat als Zwischenprodukt, das durch Coenzym A, unter Bildung von Acyl-CoA und AMP, gespalten wird. Es sind mehrere dieser Synthetasen bekannt, und sie werden nach der Länge der Kohlenstoffkette benannt, die optimale Aktivität bewirkt, z.B. Acetyl-CoA-Synthetase, die C₂- und C₃-Fettsäuren umwandelt, Octanoyl-CoA-Synthetase, die Fettsäuren mit Kettenlängen von C₄ bis C₁₂ umwandelt, und Dodecanoyl-CoA-Synthetase (C₁₀ bis C₁₈). Mitochondrien enthalten ebenfalls eine Acyl-CoA-Synthetase, die GTP in GDP + P_i spaltet. Acyl-CoA-Derivate mit kurzen Fettsäureketten können auch durch eine Transferreaktion gebildet werden, bei der die Thiophorase die -SCoA-Gruppe von Succinyl-CoA überträgt: Succinyl-CoA + RCOOH

Succinat + R-CO-SCoA. Im Organismus stehen die aktivierten Fettsäuren im Gleichgewicht mit Acylcarnitin. Sie stellen den Ausgangspunkt für den Fettsäureabbau dar.