Hexokinase (EC 2.7.1.1), ein Enzym, das die Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf den C6-Sauerstoff von Glucose oder anderen Hexosen, wie z. B. Mannose oder D-Glucosamin, katalysiert. Das physiologische Substrat ist MgATP. Die Reaktion mit Glucose stellt den ersten Schritt in der Glycolyse dar. Die H. bindet spezifisch an Porin, ein Protein der äußeren Mitochondrienmembran, das ADP und Sacchariden den Durchtritt durch diese Membran erlaubt. Obwohl die H. ein lösliches Protein ist, scheint sie unter physiologischen Bedingungen mit der Mitochondrienmembran verbunden zu sein. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass die mitochondriengebundene H. einen höheren K_m-Wert für MgATP (0,25mM gegenüber 0,12mM für nichtgebundene H.) besitzt und gegen die Produktinhibierung durch Glucose-6-phosphat empfindlicher ist.
Röntgenstrukturuntersuchungen von Hexokinasekristallen, die in Gegenwart und Abwesenheit von Glucose gewachsen waren, zeigen, dass bei Vorliegen von gebundener Glucose ein Teil des Moleküls um 12° rotiert und dabei die Substratbindungsspalte um das Glucosemolekül schließt. In dieser Konformation wird Wasser aus der Spalte ausgeschlossen. In wässriger Lösung führt die Hexokinase die gleichen Konformationsänderungen durch und Glucoseanaloga, die zu sperrig sind, um eine Konformationsänderung herbeizuführen, sind keine Substrate dieses Enzyms, in manchen Fällen jedoch Inhibitoren. Obwohl Wasser in der Substrattasche an der gleichen Position wie die 6-OH-Gruppe des Zuckers binden kann, induziert es weder eine Konformationsänderung, noch wird es schnell phosphoryliert (dies würde zur Hydrolyse von ATP führen; H. besitzt keine hohe ATPase-Aktivität). Durch die Bindung werden die Enthalpie und die Wärmekapazität des Enzyms kaum verändert. [B.I. Kurganov in G.R.Welch (Hrsg.) Organized Multienzyme Systems Academic Press, Orlando, 1985, 241-268; K. Takahashi et al. Biochem. 20 (1981) 4.693-4.697; W.S. Bennett u. T.A. Steitz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75 (1978) 4.848-4.852]