Phosphodiesterasen, phosphodiesterspaltende Enzyme, zu denen die Endonucleasen Ribonuclease und Desoxyribonuclease I und II sowie die mehr unspezifischen Exonucleasen zählen. Letztere bauen sowohl DNA wie RNA stufenweise vom 5'-Hydroxylende her ab, so dass entweder 5'-Mononucleotide (Schlangengift-P., EC 3.1.4.1) oder 3'-Mononucleotide (Milz-P., EC 3.1.16.1) entstehen. Die P. wurden erfolgreich zur Sequenzermittlung von Nucleinsäuren (speziell RNA) eingesetzt. Die 3':5'-zyklische Nucleotid-P. (EC 3.1.4.17) katalysiert Biosynthese und Abbau von cyclo-AMP (Adenosinphosphate).