Schmelzpunkt, T_m, t_m, diejenige Temperatur – in °C – bei der eine doppelsträngige Nucleinsäure zu 50 % in die einzelsträngige Form denaturiert wird. Eine DNA-Lösung wird erhitzt und deren Absorption bei 260 nm in Abhängigkeit von der Temperatur aufgetragen. Der Übergang von doppel- zu einzelsträngiger DNA vollzieht sich in einem relativ engen Temperaturbereich und ist durch eine Absorptionszunahme bei 260 nm charakterisiert (das Schmelzen der DNA ist auch von einer markanten Viskositätsabnahme, Änderung der optischen Rotation und Dichtezunahme begleitet). T_m entspricht der Temperatur am Mittelpunkt (an der Hälfte der Absorptionszunahme bei 260 nm) der S-förmigen Kurve. Die Schärfe des Übergangs deutet auf eine kooperative Strukturänderung des gesamten Moleküls hin (T_m liegt oberhalb der Temperatur, die notwendig ist, die Stapelung der Basen aufzuheben und eine Einzelstranghelix zerstören, was jedoch durch Wasserstoffbindungen zwischen den beiden Helices verhindert wird; eine Trennung der beiden Stränge erfolgt, wenn die Wasserstoffbindungen zwischen den Basenpaaren gebrochen sind). Im Gegensatz dazu zeigt einzelsträngige RNA über einen weiten Temperaturbereich nur eine allmähliche Absorptionszunahme und besitzt keinen T_m.

Unter Standardbedingungen für pH und Ionenstärke verhält sich T_m proportional zur Molekülstabilität. Da das Basenpaar Guanin-Cytosin (Basenpaarung) drei Wasserstoffbindungen besitzt und Adenin-Thymin nur zwei Wasserstoffbindungen, besteht zwischen dem GC-Gehalt der DNA und ihrer T_m eine lineare Beziehung: T_m = 69°C + 0,41 (Mol-% GC), d.h. je höher der Wasserstoffbindungsanteil ist, um so höher ist die Temperatur, die benötigt wird, um den Strang der Doppelhelix zu trennen.