METHODEN

Mikroskopie

Die wenigsten biologischen Objekte sind von Natur aus gute lichtmikroskopische Präparate, da sie häufig farblos und Strukturen nur schwer oder gar nicht erkennbar sind. Tote und fixierte Objekte können durch geeignete Färbemethoden behandelt werden, bei denen sich Farbstoffe z.T. selektiv an bestimmte Strukturen anlagern. Lebendes Material wie z.B. Zellkulturen können nicht ohne weiteres gefärbt werden. Da Unterschiede im Brechungsindex ihrer Strukturen die Phasenlage des Lichtes, nicht aber seine Amplitude verändern, werden ungefärbte Präparate auch als Phasenpräparate bezeichnet. Eine Reihe von technischen, so genannten optischen Kontrastierungsverfahren ermöglicht es bei solchen Objekten unter Ausnutzung bestimmter physikalischer Eigenschaften, Kontraste zu erzeugen, die für das menschliche Auge wahrnehmbar sind.

Hellfeldmikroskopie

Die Hellfeldmikroskopie ist das einfachste mikroskopische Betrachtungsverfahren. Bei ihr wird das Präparat vom Licht durchstrahlt, wobei das Objekt an den Stellen dunkler erscheint, an denen es einen Teil der Lichtstrahlen herausfiltert oder abdeckt. Mit dieser einfachen Technik sind die Umrisse einzelner Zellen nur schwer auszumachen und Details kaum zu erkennen. Der Kontrast kann jedoch durch geeignete Färbeverfahren erhöht werden. Da dadurch die Amplitude der durchstrahlenden Lichtwellen geschwächt wird, werden gefärbte Proben auch als Amplitudenobjekte bezeichnet.

Dunkelfeldmikroskopie

Eines der ältesten mikroskopischen Verfahren zur Darstellung von Phasenpräparaten, bei dem kein direktes Licht in das Objektiv gelangt, ist die Dunkelfeldmikroskopie. Das Präparat wird hierzu nicht mit einem Kegel, sondern nur mit einem Kegelmantel beleuchtet, wobei das Objekt in einem so schwachen Winkel durchstrahlt wird, dass es nicht in die Apertur des Objektivs eintreten kann und dadurch nur gebeugtes Licht das Bild des Objektes durch Interferenz erzeugt. Befindet sich kein Präparat im Strahlengang, so bleibt das Gesichtsfeld beim Blick in das Okular völlig dunkel. In Anwesenheit eines Präparates im Strahlengang kommt es zu einer teilweisen Ablenkung durch Streuung und Beugung im Präparat. Dieses abgelenkte Licht erzeugt ein Bild in der Zwischenbildebene, wobei nur ein Teil des Lichtes in das Objektiv gelangt und durch Interferenz ein Bild erzeugt. Die Präparate werden dadurch hell leuchtend auf einem dunklen Untergrund, dem Dunkelfeld, dargestellt.

Generell kann ein Dunkelfeld auf zwei verschiedene Weisen erzeugt werden: Die Aperturblende des Kondensors wird durch eine preiswerte Zentralblende ersetzt oder es kommen spezielle, relativ teure Spiegelkondensoren zum Einsatz. Das an Linsenkondensoren entstehende Reflexlicht wird hierdurch vermieden. Die für die Dunkelfeldmikroskopie geeigneten Präparate müssen zunächst relativ dünn sein, da Objekte ober- und unterhalb der Schärfeebene zu einer beträchtlichen Aufhellung des Gesichtsfeldes führen. In den letzten Jahrzehnten wurde diese Untersuchungsmethodik teilweise durch das Phasenkontrastverfahren ersetzt. ( vgl. Abb. )

Phasenkontrastmikroskopie

Mit diesem Verfahren können von Natur aus kontrastarme Objekte wie z.B. Bakterien, Geißeln, Zellkerne, die im Hellfeld schlecht zu erkennen sind, kontrastreicher dargestellt werden. Der Phasenkontrast wurde von dem holländischem Physiker F. Zernike entwickelt (Nobelpreis 1953).

Bei dieser Technik werden Unterschiede im Brechungsindex des Objekts ausgenutzt. Unterschiedliche Brechungsindices verursachen eine Differenz in der Lichtgeschwindigkeit, sodass es zu einer Phasenverschiebung und als Folge zu einer Verstärkung oder Verminderung der Lichtintensität durch Interferenz kommen kann. Da die Brechungsindices und damit die Phasenunterschiede der Lichtwellen in Zellen gewöhnlich sehr klein sind, wird das Licht der Nebenmaxima gegen das Licht im Hauptmaximum durch eine dünne Schicht (so genanntes Phasenplättchen) verschoben. So entsteht durch Interferenz von Haupt- und Nebenmaxima ein kontrastreiches, aber auch etwas lichtschwaches Bild. Bei der Phasenkontrastmikroskopie werden die Phasenunterschiede in dem Präparat durch Eingriffe in den Strahlengang deutlich sichtbar gemacht. Hierzu benötigt man einen geeigneten Kondensor mit einer oder mehreren im Durchmesser unterschiedlichen Ringblenden und Phasenkontrastobjektive mit einem zur jeweiligen Ringblende passenden Phasenring. Sie sind mit der Gravur Ph und meistens auch mit einer Zahl (wie z.B. bei Zeiss mit 1, 2 oder 3), für die am Kondensor einzustellende Ringblende gekennzeichnet. ( vgl. Abb. )

Interferenzkontrastmikroskopie

Diese Technik ähnelt der Phasenkontrastmikroskopie, es werden jedoch nicht die Phasen getrennt voneinander verarbeitet, sondern voneinander getrennte Strahlengänge, die z.B. mit Hilfe von Spiegeln oder Prismen entstehen. Beim Phasenkontrastmikroskop wirken die Objekte selbst als Strahlungsteiler. Mit dem Verfahren lässt sich ein Reliefkontrast einstellen. Aus dem reliefartigen Aussehen des Bildes darf jedoch nicht auf einen reliefartigen Aufbau im Objekt geschlossen werden. Die theoretischen Grundlagen des differentiellen Interferenzkontrastes (DIK) sind äußerst komplex. Es bestehen zudem verschiedene Konstruktionsmöglichkeiten. Bei der weit verbreiteten Anordnung nach Nomarski durchläuft das Licht zunächst einen Polarisationsfilter (Polarisator). Die polarisierten Lichtwellen werden durch ein so genanntes Nomarski-Prisma in zwei kohärente Teilstrahlen gleicher Amplitude aufgespalten. Gleichzeitig erzeugt das Nomarski-Prisma noch einen Gangunterschied zwischen diesen beiden Teilstrahlen. Durch den Kondensor werden diese parallel zueinander ausgerichtet, sodass sie die Objektebene in einem bestimmten Abstand zueinander passieren. Dieser Abstand ist in der Realität sehr gering und liegt unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskops. Die beiden Teilstrahlen passieren dann ein zweites Nomarski-Prisma, wo sie wieder zusammengeführt werden. Dieses Nomarski-Prisma ist i.d.R. senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops verschiebbar. Dadurch lässt sich der Gangunterschied zwischen den beiden Wellenzügen stufenlos verändern. Oberhalb befindet sich ein weiterer Polarisationsfilter (Analysator). Der eigentliche, reliefartige Bildkontrast wird durch die beschriebene Modifizierung des Basisgangunterschiedes bestimmt.

Fluoreszenzmikroskopie

Ausgenutzt wird bei diesem Verfahren die Tatsache, dass manche biologischen Strukturen und Moleküle bei Bestrahlung mit ultraviolettem oder Blaulicht fluoreszieren, d.h. Licht emittieren, das eine größere Wellenlänge als das anregende Licht besitzt. Es kann mit Hilfe bestimmter Filter betrachtet werden, die das Anregungslicht ausblenden. Proteine und Nucleinsäuren können mit Fluorochromen markiert werden, sodass z.B. DNA direkt durch das Fluorchrom DAPI (4,6-Diaminophenylindol) oder bestimmte Proteine nach Behandlung mit Antikörpern nachgewiesen werden können.

Konfokale Laserscanning-Mikroskopie

Im Unterschied zu den bereits beschriebenen Verfahren wird das Präparat nicht ausgeleuchtet, sondern mit einem feinen Krypton-Argon-Laser abgerastert. Das reflektierende Licht wird von einem Detektor wahrgenommen. Wie ein „Lichtpinsel“ gleitet der Strahl dabei über eine Ebene des Objektes, eine Lochblende im Strahlengang zum Detektor sorgt dafür, dass Licht außerhalb der Brennebene ausgeblendet wird. Durch schrittweise Fokussierung auf unterschiedliche Ebenen können Einzelbilder erstellt werden, mit deren Hilfe sich am Computer ein dreidimensionales Bild zusammensetzen lässt.

Literatur: Schade, K.H.: Lichtmikroskopie Technologie und Anwendungen. Die Bibliothek der Technik Band 82, Landsberg/Lech 1993.

Mikroskopie: Dunkelfeldaufname eines Rädertierchens (Stephanoceros fimbriatus)

Mikroskopie: Vergleich von Hellfeldmikroskopie (a) und Phasenkontrastmikroskopie (b) am Beispiel eines Speicheldrüsenchromosoms. Das Phasenkontrastmikroskop erzeugt ein deutlich kontrastreicheres Bild