METHODE

Trennverfahren

Im Zusammenhang mit der Erforschung der verschiedensten biologischen Phänomene stoßen Wissenschaftler immer wieder auf komplexe Gemische von Biomolekülen, deren Wirkung nur dann besser verstanden werden kann, wenn auch die einzelnen Bestandteile eines Gas- oder Flüssigkeitsgemisches bekannt sind. Zu diesem Zweck werden nicht nur die üblichen Standardtrennverfahren wie Chromatographie oder Elektrophorese eingesetzt, sondern auch Kombinationen dieser Methoden untereinander bzw. mit anderen Analyseverfahren wie z.B. von immunlogischen und spektroskopischen Methoden.

Zu den wichtigen Trennverfahren für Biomoleküle gehört die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC, engl. high performance liquid chromatography), die sich durch eine hohe Trennfähigkeit von kleinsten Probemengen im Pico- bis Femtogramm-Bereich (10^–12 g bis 10^–15 g) innerhalb kürzester Zeit auszeichnet und z.B. für die qualitative und quantitative Analyse von Proteinen und Kohlenhydraten geeignet ist. Dabei wird unter Verwendung geeigneter Pumpsysteme mit hohem Druck (bis über 10⁷ Pa) und einer stabilen Phase gearbeitet, deren Partikelgröße zwischen 5 und 10 μm beträgt. Die HPLC kann, je nach deren Beschaffenheit, folglich mit einer Vielzahl von Chromatographietypen eingesetzt werden (z.B. Adsorptionschromatographie, Gelfiltration usw.), wobei auch die zur Trennung und Aufreinigung erforderliche Gradientenelution möglich ist.

Eine Kombination mehrerer Analyseverfahren stellt die Kopplung von Gaschromatographie und Massenspektroskopie dar, die ursprünglich vor allem zur Strukturaufklärung verwendet wurde. Das so genannte GC-MS-Verfahren wird inzwischen routinemäßig in vielen Labors eingesetzt, wenn Gemische flüchtiger oder leicht zu verflüchtigender Verbindungen untersucht werden müssen. Die hohe Empfindlichkeit erlaubt es dabei, nur sehr geringe Mengen deutlich unter dem μg- und μl-Bereich als Probenmaterial einzusetzen. ( vgl. Abb. )

Die durch Gaschromatographie getrennten Substanzen gelangen im Anschluss in ein Massenspektrometer. Hier werden die organischen Verbindungen durch Elektronenbeschuss oder Reaktion mit Ionen organischer Kohlenwasserstoffe ionisiert, wobei Moleküle häufig in positiv geladene Fragmente verschiedener Massen zerschlagen werden. Das Prinzip der Massenspektroskopie beruht auf der Tatsache, dass ein bewegtes Ion durch ein magnetisches Feld als Funktion von Masse und Geschwindigkeit abgelenkt wird. Ionen mit einer größeren kinetischen Energie werden dabei weniger abgelenkt als Ionen mit niedrigerer Energie. Das Massenspektrometer misst, wie stark eine in der Ionisationskammer ionisierte Gasmischung durch ein im Analysator angelegtes Magnetfeld abgelenkt wird, an dessen Ende sich ein Ionenkollektor befindet, der Signale an einen Verstärker weiterleitet. Massenspektren bestehen aus einer Reihe von Linien und so genannten Peaks, die Werte des Masse-Ladungs-Verhältnis m/e angeben und deren Höhe der relativen Menge einer Substanz entspricht. Die Spaltungsmuster vieler Verbindungen sind bekannt und liegen als Datensätze bzw. Diagramme vor, sodass eine vergleichende Analyse zwischen Gasgemisch und Referenzen möglich ist. Ein Beispiel für GS-MS-Untersuchungen ist in untenstehender Abbildung ( vgl. Abb. ) gezeigt, die das Ergebnis einer Analyse von Blüteninhaltsstoffen darstellt.

Eine Weiterentwicklung in Bezug auf Empfindlichkeit und Anzahl der innerhalb eines Zeitraums zu analysierenden Proben stellt die so genannte Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation-Time-of-Flight- (MALDI-TOF)-Massenspektroskopie dar. Bei ihr werden die zu analysierenden Proben in eine geeignete Matrix eingebettet und durch einen kurzen Laserimpuls freigesetzt und ionisiert (MALDI). Das in der Gasphase befindliche Ion wird durch eine angelegte Spannung beschleunigt und die Flugzeit bis zum Detektor gemessen (TOF). Das Verfahren wurde entwickelt, um z.B. Biomoleküle mit großen Massen wie DNA zu analysieren. Eine Messung ist in Sekundenbruchteilen abgeschlossen, sodass sich sehr viele Proben in kurzer Zeit analysieren lassen. Darüber hinaus eignet sie sich dazu, die Sequenz der Bausteine eines DNA-Moleküls zu bestimmen. Außerdem lassen sich mittels MALDI-TOF Protein- und DNA-Fragmente aufgrund ihres Molekulargewichts genau identifizieren.

Trennverfahren: Schematischer Aufbau einer GC-MS-Anlage. Die Probe wird zunächst in den Gaschromatographen eingespritzt und gelangt dann in das Massenspektrometer. Flüchtige Verbindungen, die durch Adsorption an einem inerten Trägermaterial für die Analyse gesammelt wurden, müssen zunächst aus einer Desorptionsanlage freigesetzt werden

Trennverfahren: Massenspektrum als Ergebnis einer GS-MS-Analyse. Die Höhe der Peaks gibt die relative Menge einer Verbindung bzw. eines Fragmentes an. Nummern über den Peaks dienen der individuellen Identifizierung einzelner Linien