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Lexikon der Biologie: anchored PCR

anchored PCR, Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Analyse von Transkripten durch Amplifikation von unbekannten Regionen 5´- bzw. 3´-flankierend zu bereits bekannten Sequenzen. Das Prinzip der anchored PCR beruht darauf, eine Insel bekannter Sequenz im noch unbekannten Bereich zu erzeugen. Praktisch geschieht dies entweder durch Anhängen eines Homopolymerschwanzes an die Nucleinsäure oder, indem man einen in der Nähe vermuteten Homopolymerbereich als "bekannte" Sequenz benutzt. Die Inseln bekannter Sequenz (zu Beginn bekannte Sequenz und Homopolymersequenz) werden zur Auswahl von primern benutzt, mit denen man in einer PCR den unbekannten Zwischenbereich amplifizieren kann. Die RNA muß zunächst mit Hilfe reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden. Handelt es sich um nucleär codierte mRNA, so kann in der Regel zum poly(A)-Schwanz komplementäres Oligo-desoxy-Thymidin als primer für reverse Transkriptase verwendet werden. Hiermit hat man zugleich den für die Amplifikation einer 3´ zur bekannten Region liegenden Sequenz notwendigen Homopolymerbereich bzw. im Oligo-dT-primer einen der beiden Amplifikations-primer in der Hand. RNA ohne poly(A)-Schwanz kann zunächst mit Hilfe des Enzyms poly(A)-Polymerase am 3´-Ende polyadenyliert (Polyadenylierung) werden und ist somit der gleichen Vorgehensweise zugänglich. Um unbekannte 5´-Enden zu amplifizieren, wird die RNA zunächst mit einem spezifischen primer oder wiederum Oligo-dT in cDNA umgeschrieben. Die erhaltenen, zur RNA komplementären Produkte sollten alle die gleiche Länge besitzen, und zwar vom primer ausgehend bis zum Transkriptionsstart der RNA. An das 3´-Ende der cDNA, das gegenüber dem Transkriptstartnucleotid liegt, kann nun mit dem Enzym terminale Transferase ein Homopolymer (meist Oligo-dG) ansynthetisiert werden. So ist man auch hier in der Lage, die Region zwischen zwei bekannten Sequenzen via PCR zu amplifizieren und somit einer weiteren Analyse zugänglich zu machen.

P.Z.



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