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Lexikon der Biologie: HAT-Selektion

HAT-Selektionw, eine Methode zur Identifizierung eukaryotischer Zellen mit HGPRT- oder TK-negativem bzw. positivem Phänotyp (HGPRT = Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, TK = Thymidin-Kinase). Das hierbei eingesetzte Selektionsmedium (HAT-Medium) enthält den Folsäure-AntagonistenAminopterin, wodurch u.a. die endogene Neusynthese von Purinen und damit schließlich die Neusynthese von Bausteinen für die DNA- und RNA-Synthese in den Zellen der Kultur verhindert wird ( vgl. Abb. ). Normale Zellen können jedoch, auch unter nicht selektierenden Bedingungen, einen Großteil der bereits vorliegenden Purine, die z.B. aus dem Nucleinsäureabbau stammen, über den salvage pathway wieder in die entsprechenden Nucleosidmonophosphate (IMP, AMP, GMP) überführen und für die erneute Synthese von Nucleinsäuren verfügbar machen. Da ein zentrales Enzym dieses Weges die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase ist, werden im HAT-Medium die Zellen absterben, bei denen dieses Enzym nicht funktionsfähig ist (HGPRT–-Phänotyp). Zellen mit aktiver HGPRT (HGPRT+) hingegen werden das im Medium enthaltene Hypoxanthin nutzen und überleben. Mit Hilfe dieser Selektion konnten HGPRT–-Zellen in verschiedenen Zellkulturen gefunden werden. Das im HAT-Medium außerdem enthaltene Thymidin hat die Funktion, den ebenfalls durch Aminopterin hervorgerufenen Block der Synthese von dTMP aus dUMP (Desoxyribonucleoside) zu umgehen, da das Enzym Thymidin-Kinase (TK) Thymidin aus dem Medium direkt phosphorylieren und für die DNA-Synthese verfügbar machen kann. Mit Hilfe der HAT-Selektion konnten auch Zellen gefunden werden, die TK–-Phänotyp aufweisen, da auch sie in diesem Medium nicht überleben (Block der dTMP-Neusynthese und keine Nutzungsmöglichkeit des Thymidins aus dem Medium). Die so isolierten HGPRT–- bzw. TK–-Zellen konnten im folgenden in Transformations-Experimenten eingesetzt werden, bei denen sie mit DNA transformiert wurden, die ein HGPRT–- bzw. TK–-Gen enthielt. Nach Überführen der transformierten HGPRT–- bzw. TK–-Zellen in HAT-Medium können nur die Zellen überleben, die ein aktives Gen erhalten haben. Die HAT-Selektion ist somit neben der G418-Selektion eine weitere Möglichkeit, die Transformation von eukaryotischen Zellen mit fremder DNA zu verfolgen und entsprechende Klone zu selektieren.

E.G.



HAT-Selektion

Vereinfachtes Schema der Synthese von Nucleinsäuren (DNA, RNA) und Wirkstellen der aktiven Komponenten des HAT-Mediums (unterstrichen). Der Block bestimmter Schritte innerhalb der Synthesewege durch Aminopterin ist durch einen Doppelstrich dargestellt. Eine Umgehung des Blocks ist durch die Nutzung von Hypoxanthin bzw. Thymidin aus dem Medium durch HGPRT (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase) bzw. TK (Thymidin-Kinase) möglich.

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