Lexikon der Biologie: in-vitro-Evolution
in-vitro-Evolutionw, Erzeugung von Nucleinsäuren mit bestimmten Eigenschaften durch gerichtete Selektion, Amplifikation und Mutation im Reagenzgefäß. In-vitro-Evolution arbeitet nach den Prinzipien der Darwinschen Evolutionstheorie, ist jedoch nicht an Zellen oder Organismen gebunden, sondern agiert auf molekularem Niveau (zum Ablauf von in-vitro-Evolution vgl. Abb. ), wobei eine heterogene Population von Nucleinsäuren in mehreren Zyklen bezüglich einer bestimmten chemischen Eigenschaft getestet wird. Zu Beginn eines Versuchs werden in der Regel 1012 bis 1018 verschiedene Ausgangsmoleküle mit einer Häufigkeit von ca. 10 pro Molekülart eingesetzt (bis zu 1,6 mg Ausgangsmasse!). Die Ausgangsmoleküle bestehen im einfachsten Fall alle aus identischen terminalen Sequenzabschnitten, zwischen denen gleich lange, aber völlig zufällige Nucleotidabfolgen vorhanden sind ( vgl. Abb. a). Alle Ausgangsmoleküle werden nun hinsichtlich der Erfüllung einer bestimmten Eigenschaft getestet. Moleküle, welche die geforderte Eigenschaft aufweisen, werden von nicht geeigneten Molekülen getrennt. Da im allgemeinen nur äußerst wenige Moleküle „erfolgreich“ sind und deren Mengen unterhalb der Möglichkeiten jeder Nachweismethode liegen, ist eine sich an den Selektionsschritt anschließende Vermehrung nötig. Diese erfolgt meist über Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die zur Amplifikation verwendeten primer binden an konstanten terminalen Regionen, die allen Ausgangsmolekülen gemeinsam sind. Nach Amplifikation der „erfolgreichen“ Moleküle können diese einer erneuten Auslese – im allgemeinen unter strikteren Auswahlbedingungen – unterzogen werden. Über mehrere Zyklen der Auslese und unter sukzessiver Erhöhung des Selektionsdrucks können dadurch bestimmte Molekülarten mit gewünschten Eigenschaften angereichert werden (in-vitro-Selektion; SELEX). Um den Darwinschen Prinzipien zu entsprechen, kann man auch Zeitgrenzen zur Ausführung einer gewünschten Funktion setzen (bei Ribozym-katalysierten Reaktionen; Ribozyme). Von einer besonders erfolgreichen (schnellen) Molekülart werden mehr Einzelmoleküle im vorgegebenen Zeitintervall die Selektionserfordernisse erfüllen können. Dies führt beim anschließenden Amplifikationsschritt automatisch zur Produktion einer erhöhten Nachkommenzahl im Vergleich zu weniger geeigneten Molekülvarianten. Um aus einem solchen System schließlich ein tatsächlich evolutionäres zu machen, können beim Amplifikationsschritt beabsichtigt Mutationen gesetzt werden (z.B. über error prone PCR), so daß die Nachkommen (Amplifikate) ähnlich, aber nicht identisch mit „erfolgreichen“ Elternmolekülen sind. Die Einfügung solcher Schritte ist zur Erzeugung besonders geeigneter Molekülarten notwendig, da in einer Ausgangspopulation niemals alle potentiellen Moleküle vorhanden sind (bei einer DNA mit nur 100 Nucleotiden sind bereits 4100 verschiedene Varianten möglich!). Ein solches Vorgehen ist insbesondere bei der Selektion auf komplexe Eigenschaften, wie die Ausführung einer chemischen Reaktion, nötig, da in primären Auswahlrunden in der Regel nur moderat aktive Molekülarten angereichert werden können. Durch die Einfügung von Mutationen während der Amplifikation werden verbesserte Varianten bereits erfolgreicher Molekülarten erzeugt, die dann in weiteren Auswahlrunden unter verschärften Selektionsbedingungen „erfolgreich“ sind. – In-vitro-Evolution wurde in ihrer heutigen Form erstmals 1990 zum einen von Ellington und Szostak, zum anderen von Tuerk und Gold publiziert. Inzwischen sind viele über in-vitro-Evolution erzeugte oder verbesserte Aptamere und Ribozyme beschrieben worden. Die enorme Leistungsstärke von in-vitro-Evolution wird am Beispiel eines evolvierten Thrombin-Aptamers deutlich, dessen Einsatz als blutgerinnungshemmendes Therapeutikum möglich ist. evolutive Biotechnologie, molekulare Evolution.
P.Z.
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in-vitro-Evolution
a Flußschema der in-vitro-Selektion von RNA-Aptameren. Die Population von Ausgangsmolekülen enthält terminal identische Sequenzen für Amplifikation und Transkription. Intern sind die Sequenzen zufällig, in der Regel sind 1012–1018 Molekülvarianten vorhanden (1). Nach Transkription werden die Moleküle über eine Affinitätssäule gegeben (2). Nicht spezifisch gebundene RNA-Moleküle werden abgewaschen. Spezifisch gebundene RNA-Moleküle werden im Anschluß mit dem Säulenliganden eluiert. Die so ausgewählten RNA-Moleküle können nach reverser Transkription (3), PCR (4) und Transkription einem neuen Selektionszyklus unterworfen werden.
b Flußschema der in-vitro-Evolution eines Gruppe-I-Ribozyms. Eine Population von mutierten Gruppe-I-Ribozymen wird unter selektionierenden Reaktionsbedingungen (z.B. Ca2+ anstatt Mg2+ als Cofaktor) inkubiert (1). Die katalytische Aktivität von dennoch aktiven Ribozymen (hellgrau) führt zur Kopplung des 3'-terminalen Bereichs des Substrats (schwarz gepunktet) an die 3'-Enden der aktiven Ribozyme. Im Anschluß findet reverse Transkription mit einem zur angekoppelten Substratsequenz komplementären primer 1 statt (2). Ribozyme, die nicht in der Lage waren, die Kopplungsreaktion auszuführen, werden aufgrund der fehlenden Bindestelle für den primer 1 nicht revers transkribiert und somit ausselektioniert. Die erhaltene cDNA (dunkelgrau) wird mit einem primer 2 und dem primer 1 mittels PCR amplifiziert (hier können Mutationen eingebracht werden). Der 5'-terminal überhängende Bereich von primer 2 enthält T7-Promotor-Sequenzen (3). In einer zweiten PCR mit primer 2 und 3 wird der durch die Katalyse angehängte Sequenzabschnitt entfernt (4). Ribozyme für einen erneuten Selektions-Amplifikationszyklus erhält man durch Transkription mit T7-RNA-Polymerase (5).
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