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Lexikon der Biologie: isoelektrische Fokussierung

isoelektrische Fokussierungw, Abk. IEF, elektrische Fokussierung, Elektrofokussierung, eine elektrophoretische Methode (Elektrophorese), bei der Proteine in einem pH-Gradienten wandern, bis sie an den sog. isoelektrischen Punkt (pI) gelangen, an dem ihre Nettoladung neutral ist. Ungeladene Proteine bewegen sich nicht mehr weiter durch das Gel, so daß sich schließlich alle Proteine an ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt befinden. Die IEF ist für sich und als Bestandteil der zweidimensionalen Gelelektrophorese für die Proteinanalytik bzw. die Proteomik von wesentlicher Bedeutung. – Als Trennmedien eignen sich sowohl Agarosegele (Agar) als auch Polyacrylamidgele (Polyacrylamid-Gelelektrophorese). Zur Herstellung von pH-Gradienten werden freie Träger-Ampholyte oder fest in das Gel eingebundene Immobiline verwendet. Trägerampholyte sind Gemische aus Hunderten verschiedener aliphatischer Oligo-Aminosäuren und Oligo-Carbonsäuren, die sich in ihren isoelektrischen Punkten unterscheiden. In ein Gel mit eingegossen wandern nach Anlegen eines elektrischen Feldes negativ geladene saure Trägerampholyte Richtung Anode, positiv geladene basische Trägerampholyte Richtung Kathode, bis sie ihren jeweiligen pI erreichen. Diesen pH-Wert vermitteln sie an ihre Umgebung und bilden so einen kontinuierlichen pH-Gradienten. Trägerampholyte halten als zwitterionische (Zwitterionen) Puffer Proteine in Lösung, sie haben hohe Pufferkapazität und gleichmäßige elektrische Leitfähigkeit am pI. Gele mit freien Trägerampholyten sind einfach herzustellen, allerdings sind damit durchgeführte Trennungen nur schwer reproduzierbar. Immobiline sind Acrylamidderivate mit definierten pK-Werten, die der Herstellung immobilisierter pH-Gradienten dienen. Dazu benötigt man mindestens 2 verschiedene Immobiline, eine schwache Säure und eine schwache Base, deren Mischungsverhältnis man während des Gelgießens, entsprechend dem Vorgehen bei anderen Gradientengelen (Gelelektrophorese), verändert. Bei der Polymerisierung des Gels wird durch kovalente Bindung der Immobiline an das Polyacrylamid-Netzwerk der pH-Gradient immobilisiert. In der Regel werden die Gele auf Trägerfolien aufpolymerisiert und getrocknet und zum Gebrauch wieder aufgequollen. Die Gele sind zwar aufwendig in der Herstellung, jedoch sind mit immobilisierten – linearen oder nicht-linearen – pH-Gradienten gut reproduzierbare Trennungen mit sehr hohen Auflösungen in engen pH-Bereichen möglich. Azurine.

Copyright 1999 Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
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