Maxam-Gilbert-Methode

Lexikon der Biologie: Maxam-Gilbert-Methode

Maxam-Gilbert-Methodew, eine Nucleinsäure-Sequenzierungsmethode (Sequenzierung), die von A. Maxam und W. Gilbert 1979 vorgestellt wurde. Hierbei wird ein terminal-markiertes DNA-Fragment 4 unterschiedlichen chemischen Reaktionen unterworfen, die jeweils zu einer Modifikation eines bestimmten Basentyps (A, C, G, T) führt (Basenmodifikation). Die Reaktionen sind dabei so eingestellt, daß im Schnitt nur 1 Base pro Molekül modifiziert wird. Die Einwirkung von Dimethylsulfat führt zu einer Methylierung (Basenmethylierung) von Guanin (m⁷G) und Adenin (m³A). Die modifizierten Basen lassen sich anschließend bei unterschiedlichem pH-Wert aus der Nucleinsäure-Kette abspalten. So führt pH 7,0 und eine Temperatur von 90 °C zur hauptsächlichen Abspaltung von modifiziertem G, pH 2,0 und 0 °C zur vorwiegenden Abspaltung von A, pH 12 und 90 °C bewirkt schließlich einen Strangbruch an der A-Purinstelle. Pyrimidine (C, T) werden mit Hydrazin modifiziert. Gibt man zu diesem Ansatz hohe Salzkonzentrationen, so wird eine Modifikation von Thymin durch Hydrazin unterdrückt. Nach Hydrazin-Einwirkung erhält man also ohne Salz eine Modifikation von C und T, mit Salz eine nahezu ausschließliche Modifikation von C. Solche modifizierten Pyrimidine können mit Piperidin und bei 90 °C aus einer Nucleinsäure-Kette abgespalten werden, was hier auch zu einem Strangbruch führt. Die so erhaltenen Sequenz-Reaktionen lassen sich dann, nach Denaturierung der DNA-Stränge, in hochauflösenden Harnstoff-Gelen auftrennen und auswerten.

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