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Lexikon der Biologie: nick translation

nick translationw [engl.], Methode zur internen Markierung von DNA, die auf partieller Neusynthese beruht ( vgl. Abb. ). In das zu markierende Fragment werden zunächst durch limitierte Einwirkung von DNase I Einzelstrangbrüche (nicks) in den DNA-Doppelstrang eingeführt. Die DNase wird danach wieder abgetrennt. Die zufallsgemäß verteilten Einzelstrangbrüche werden von zugesetzter DNA-Polymerase I aus Escherichia coli als Startstellen (primer) für DNA-Neusynthese akzeptiert. An das freie 3'-OH-Ende des nicks werden durch die 3'→5'-Polymerase-Aktivität der DNA-Polymerase Nucleotide angehängt, wobei der Komplementärstrang als Matrize dient. Durch die 5'→3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase werden gleichzeitig die in Syntheserichtung liegenden Basen am freien 5'-Ende des nicks abgebaut. Es kommt somit zum synchronen Ersatz der abgebauten Basen durch die neu eingebauten (Replacement-Synthese), wobei der nick in Richtung des 3'-Endes des betreffenden Stranges "wandert" (nick translation). Die Markierung eines DNA-Fragments kann unter Ausnutzung dieser Aktivitäten einfach durch Ersatz eines oder mehrerer der für die DNA-Synthese benötigten Nucleosidtriphosphate durch entsprechend markierte Analoga, z.B. durch α-32P-dNTPs oder Digoxigenin-dUTP (Markierung), erreicht werden. Bei Einsatz aller 4 Nucleosidtriphosphate in markierter Form können sehr hohe spezifische Aktivitäten erreicht werden. Eine zur nick translation alternative und ähnlich effektive Methode ist das random priming. Der Vorteil der nick translation besteht jedoch darin, daß hier das markierte DNA-Fragment seine ursprüngliche Länge (aufgrund der Replacement-Synthese) beibehält. Dies kann z.B. bei UV-crosslinking-Experimenten (UV-crosslinking) wichtig sein.



nick translation

Mechanismus der nick translation zur internen Markierung eines DNA-Fragments

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