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Lexikon der Biologie: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresew, Abk. SDS-PAGE, denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen. SDS-PAGE wird in der Regel als Disk-Elektrophorese nach der Vorschrift von U.K. Laemmli (1970; Laemmli-Gele) durchgeführt (Gellauf vgl. Abb. 1 ). Das vertikal orientierte Gel weist eine Zweiteilung in Sammelgel und Trenngel auf. Die mit SDS komplexierten und damit negativ geladenen monomeren (vorhandene Disulfidbindungen werden durch β-Mercaptoethanol reduziert) und gestreckten Polypeptidketten wandern im elektrischen Feld zunächst durch das Sammelgel, dann durch das Trenngel nach unten in Richtung Anode. Das Sammelgel weist gegenüber dem Trenngel 3 wesentliche Diskontinuitäten (daher Disk-Elektrophorese) auf. Es ist grobporiger, der pH-Wert des Sammelgel-Puffers ist 2 Größeneinheiten niedriger, und er weist eine wesentlich geringere Leitfähigkeit auf. Trenn- und Sammelgel enthalten Chlorid-(Cl–-)Ionen als Gegen-Ionen der Puffersubstanz Tris. Der Elektrophoresepuffer, in den die Enden des Gels reichen, enthält statt dessen Glycin. Bei Einschalten des Stroms wandern Cl–-Ionen, SDS-Proteinkomplexe sowie Glycinat-Ionen in Richtung Anode. Die Chlorid-Ionen wandern aufgrund ihrer geringen Größe am schnellsten, Glycinmoleküle dagegen am langsamsten, da das chemische Gleichgewicht zwischen ionischer und nichtionischer Form im niedrigen pH-Wert des Sammelgels weit auf die Seite der ungeladenen Form des Glycins verschoben ist und deshalb nur ein Bruchteil der Moleküle in geladener Form vorliegt. Die SDS-Proteinkomplexe bewegen sich zwischen Chlorid-Ionen-Front und Glycin/Glycinat-Molekülen. Dort herrscht ein Mangel an Ladungsträgern, der die Spannung ansteigen läßt. Die SDS-Proteinkomplexe als einzige Ladungsträger werden beschleunigt, und sie erreichen die Chlorid-Ionen-Front, an der sie, aufgrund der hohen Zahl an Ladungsträgern und der daraus resultierenden Spannungsverminderung, wieder gebremst werden. Dieser Zustand führt zu einer Konzentrierung der SDS-Proteinkomplexe auf eine scharfe Bande an der Grenze zur Chlorid-Ionen-Front. Bei Erreichen des Trenngels geht der Sammeleffekt verloren. Glycin geht vollständig in die ionische Form über (pH erhöht) und überholt aufgrund höherer Beweglichkeit die SDS-Proteinkomplexe. Diese werden jetzt entsprechend ihrer Größe getrennt. Abb. 2 zeigt ein Coomassie-Brillantblau gefärbtes Gel nach Elektrophorese. Blaue Nativ-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Gelelektrophorese, Proteinbestimmung, zweidimensionale Gelelektrophorese.

P.Z.



SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abb. 1:Gellauf. a Protein mit 2 Untereinheiten (A + B), verknüpft durch eine Disulfidbrücke; Protein (C) mit 1 Untereinheit; b Erhitzen der Proteinprobe mit β-Mercaptoethanol und anionischem SDS in Sammelgelpuffer; c Auftragen der Probe auf das Polyacrylamidgel, kein Stromfluß; d Stromfluß, Proteine im Sammelgel werden zwischen Chloridionen und Glycin konzentriert; e Stromfluß, Glycinationen haben Proteine im Trenngel überholt; Proteine werden nach Größe getrennt.



SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abb. 2: Proteinmuster (Spur 2 + 3) von Escherichia-coli-Zellen nach SDS-PAGE (Disk) und Coomassie-Brillantblau-Färbung (Spur 1 = Markerproteine mit bekannter relativer Molekülmasse)

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