Hydrogenase, eine bei Prokaryoten und einigen Eukaryoten (u. a. Algen) weit verbreitete Oxidoreductase, die reversibel Elektronen zwischen H₂ und H⁺ überträgt und so molekularen Wasserstoff bilden oder aktivieren kann. Entsprechend des Akzeptors (Coenzyms) unterscheidet man folgende H.: (1) Hydrogendehydrogenase: H₂ + NAD⁺ → H⁺ + NADH. (2) Cytochrom c₃-Hydrogenase: 2 H₂ + Ferricytochrom c₃ → 4 H⁺ + Ferrocytochrom c₃. (3) Ferredoxin-H⁺-Oxidoreductase: 2 Ferredoxin_red. + 2 H⁺ → 2 Ferredoxin_ox. + H₂.

In den verschiedenen physiologischen Gruppen der Bakterien (u. a. chemolithotrophe, methanogene, phototrophe Bakterien) erfüllt das Enzym unterschiedliche Funktionen. Die nach Art des von ihnen verwendeten Elektronendonors benannten Wasserstoffbakterien lassen sich aufgrund des Hydrogenasespektrums in drei Gruppen unterteilen: (1) Bakterien mit einer löslichen (cytoplasmatischen) H., für die NAD⁺ als primärer Elektronenakzeptor fungiert (z. B. Nocardia opaca). (2) Bakterien mit einer partikulären (membrangebundenen) H. (z. B. Paracoccus denitrificans). Die partikuläre H. reduziert nicht NAD(P)⁺, sondern überträgt die Elektronen auf die in der Membran lokalisierte Elektronentransportkette (H₂ → 2 H⁺ + 2 e). (3) Bakterien, die neben einer löslichen eine membrangebundene H. enthalten (z. B. Alcaligenes eutrophus).

Wasserstoff-oxidierende Bakterien, denen die lösliche H. fehlt, sind auf einen rückläufigen Elektronentransport zur NAD(P)⁺-Reduktion für die CO₂-Fixierung angewiesen. Hinsichtlich der Sauerstoffempfindlichkeit können zwei Typen von H. unterschieden werden: (1) H., die irreversibel durch Sauerstoff inaktiviert werden (aus anaeroben Bakterien). (2) H., die stabil gegen eine irreversible Sauerstoffinaktivierung sind und reversibel durch Sauerstoff gehemmt werden. Eine Ausnahme macht die lösliche H. aus A. eutrophus, die durch Sauerstoff weder inaktiviert noch gehemmt wird.

Die Ferredoxin-abhängige H. (aus obligat anaeroben Bakterien, z. B. Clostridium) wird durch CO gehemmt und ist von ATP unabhängig. Damit unterscheidet sie sich von der CO-unempfindlichen ATP-bedürftigen Hydrogenaseaktivität der Nitrogenase. Die Entwicklung von molekularem Wasserstoff an der Nitrogenase ist eine Konkurrenzreaktion der Stickstoffreduktion bei der Luftstickstoffbindung.

H. sind für die mikrobielle Wasserstoffbildung von potentiellem Interesse. Entsprechendes gilt für ihren Einsatz als Katalysator bei organisch-präparativen Synthesen (u. a. Cofaktor-Regenerierung) sowie für den Wasserstoff-Ionenaustausch und die Produktion von "schwerem Wasser" (D₂O).