Konfokalmikroskop s, Laser-Scan-Mikroskop, E confocal mikroscope,lichtoptisches Mikroskop (Mikroskopie), das eine dreidimensionale Darstellung transparenter Objekte ohne die üblicherweise notwendigen Dünnschichtpräparationstechniken ermöglicht. Mittels Konfokalmikroskopie kann Licht aus unterschiedlichen Ebenen des zu untersuchenden Präparats separiert werden ( siehe Abb. 1 ). Ein schichtweises Abrastern läßt mittels Rechnerunterstützung ein dreidimensionales Bild des Präparats entstehen ( siehe Abb. 2 ). Durch Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und unterschiedlichen Wellenlängen des Beobachtungslasers kann die räumliche Verteilung markierter Substanzen festgehalten werden ( siehe Abb. 3 ). Die Verbindung von stoff- mit schichtspezifischer Arbeitsweise ermöglicht eine zerstörungsfreie, dreidimensionale Beobachtung von Prozessen in lebenden Systemen. Fluoreszenzmikroskop.

Konfokalmikroskop

Abb. 1: Schematische Darstellung eines Konfokalmikroskops. Laserlicht wird über einen Scanner durch die Linsen eines Objektivs beugungsbegrenzt auf das Präparat fokussiert. Reflexions- bzw. Emissionslicht aus der Fokusebene und aus darunter- bzw. darüberliegenden Ebenen gelangt über den Scanner zu einem Strahlteiler, wo es aus dem Laserstrahlengang ausgekoppelt wird. Dieses ausgekoppelte Licht wird auf eine extrem kleine Blende (pinhole) fokussiert und trifft nach dem Blendenausgang auf ein Detektionssystem. Aus den im Bild dargestellten Strahlenverläufen des Reflexions- bzw. Emissionslichts wird ersichtlich, daß bei entsprechender Position des pinholes nur Licht aus der Fokusebene die Blende passieren kann, während Licht aus anderen Ebenen des Präparats wirksam unterdrückt wird.

Konfokalmikroskop

Abb. 2: Konfokale Aufnahme einer mit dem Fluoreszenzfarbstoff Lucifer Yellow angefüllten Nervenzelle aus einer zweiwöchigen organotypischen Kultur des medio-rostralen Neostriatum/Hyperstriatum des Haushuhnkükens. Man erkennt alle Details der Dendritenbäume einschließlich der Dornen.

Konfokalmikroskop

Abb. 3: Untersuchung der intrazellulären Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen einer neuronalen Zellkultur mittels konfokaler Mikroskopie. Die Zellen werden mit einem Calcium-sensitiven Fluoreszenzindikator (Fluo-3) beladen und danach rasterartig durch den Laserstrahl abgetastet. Die Fluoreszenz wird über eine Kamera erfaßt und mittels bildgebender Verfahren je nach Fluoreszenzstärke in Falschfarben (siehe Farbskala) übersetzt. Der Indikator zeigt im unstimulierten Zustand eine niedrige Calciumkonzentration an (Kontrolle). Werden Zellen mit dem Glutamatrezeptoragonisten NMDA behandelt, öffnen sich Ionenkanäle, Calcium strömt in die Zelle ein und setzt dabei sehr unterschiedliche zelluläre Mechanismen in Gang. Die höhere Calciumkonzentration wird durch eine verstärkte Fluoreszenz des Indikators angezeigt (Farbverschiebung in Richtung Rot und Weiß). Nach einer Auswaschphase wird das Calcium aus der Zelle herausgepumpt oder von intrazellulären Speichern aufgenommen, und schließlich kehrt die intrazelluläre Calciumkonzentration wieder zum Normalzustand zurück.
Rechts wird die statistische Auswertung des Fluoreszenzverhaltens einzelner Zellen gezeigt. In den Diagrammen sind die Mittelwerte der Fluoreszenzintensitäten pro Pixel innerhalb der zwei Quadrate, die über zwei individuelle Zellen gezeichnet sind, graphisch dargestellt (Bild links oben). Es wurde eine Serie von Bildern vor, während (schwarzer Balken) und nach NMDA-Behandlung aufgenommen. Die rote Kurve zeigt die Calciumantwort einer NMDA-sensitiven Zelle an, die grüne Kurve die einer NMDA-unsensitiven Zelle.