transgene Mäuse, Etransgenic mice, durch gezielte Manipulation des Erbguts erzeugte Mausmodelle (Modellorganismen). Die Mutation spezifischer Gene in vivo wird in der Neurobiologie als Technologie zur Erforschung der Funktion von Genen im komplexen Organismus angewendet. Die Erzeugung transgener Mäuse beruht auf zwei grundsätzlich unterschiedlichen Strategien zur Einführung der Mutation in das Genom. 1) Mit der knock-out Strategie(gene targeting Strategie) wird ein spezifischer Genlocus mittels homologer Rekombination mutiert. Dieser Ansatz wird vor allem zur Erzeugung von Nullmutationen, in denen ein bestimmtes Gen deletiert wird, verwendet (knock-out Mäuse; siehe Abb. ). Beispiele, die zu wichtigen Erkenntnissen in der Funktionsweise des Nervensystems führten, sind knock-out Mäuse von Agrin und Munc-18. Die Nullmutation von Agrin, einem sekretierten Proteoglykan, führt zu defekten motorischen Endplatten; die Analyse der Maus zeigte die essentielle Rolle von Agrin für die Bildung der neuromuskulären Synapse. Munc-18 ist ein essentielles Protein für die Exocytose von Neurotransmittern an der Synapse. Munc-18 knock-out Mäuse formen anatomisch normale Synapsen; somit wurde gezeigt, daß Synapsenbildung unabhängig von synaptischer Aktivität stattfindet. Mit Hilfe der gene targeting Strategie muß das Gen des Ziellocus nicht notwendigerweise zerstört, sondern kann auch gezielt mutiert werden, wie z.B. in Tiermodellen genetisch vererbbarer Krankheiten. 2) Die andere Strategie führt zur Erzeugung konventioneller transgener Mäuse. Der Einbau der fremden DNA, des Transgens, erfolgt im Gegensatz zur gerichteten Mutation des gene targetings ungerichtet an nicht voraussehbaren Stellen des Genoms. Die DNA wird in den parentalen Pronucleus einer befruchteten Eizelle injiziert, die anschließend in eine scheinschwangere Ammenmutter implantiert wird. Die Voraussetzung für die Etablierung einer transgenen Linie ist, wie auch bei der gene targeting Strategie, die Integration des Transgens in die sich früh differenzierenden Keimzellen, so daß die Vererbung der genetischen Manipulation möglich ist. Das injizierte DNA-Fragment besteht im allgemeinen aus einer regulatorischen Promotorsequenz, dem eigentlichen Transgen und einer Polyadenylierungssequenz. Stellt das Transgen eine unveränderte Version eines endogenen Gens dar, führt die Bildung des Transgenprodukts zu einer Überexpression. Handelt es sich beim Transgen um eine mutierte Genversion, kann die Expression die Wirkungsweise endogener Genprodukte funktionell verstärken oder abschwächen. Promotor und Integrationslocus bestimmen das Expressionsmuster des eingeführten Transgens. Da der Integrationslocus nicht vorhersehbar ist, können sich die Nachkommen jeder injizierten Eizelle in Expressionsmuster und -stärke unterscheiden. Konventionelle Transgentechnologie wird in der Neurobiologie sowohl für die analytische als auch experimentelle Fragestellung eingesetzt. Sollen bestimmte Zellpopulationen und/oder subzelluläre Strukturen markiert und sichtbar gemacht werden, können Promotoren, die zell- oder gewebespezifische Expression steuern, oder Signalpeptide, die z.B. zu dendritischer oder axonaler Lokalisation von Proteinen führen, mit Reportermolekülen wie etwa β-Galactosidase oder GFP verknüpft werden. Die Technologie der transgenen Tiere kann auch dazu genutzt werden, ein Genprodukt mittels eines bestimmten Promotors ektopisch, also an fremden Orten, oder während der Entwicklung zu unüblichen Zeitpunkten zu exprimieren, um die Funktionsweise des jeweiligen Genprodukts in vivo zu verstehen. Ein Beispiel eines solchen Ansatzes ist die ektopische Expression von Hox1-A (Hox) unter dem β-Actin-Promotor während der Embryonalentwicklung – Häufig dienen konventionelle transgene Mäuse, ebenso wie gene targeting Mäuse, als Tiermodelle für Krankheiten. Hierbei können Gene, die mit menschlichen Erbkrankheiten in Zusammenhang gebracht werden, gezielt mutiert werden. Beispiele hierfür sind Tiermodelle für die Alzheimer-Krankheit, die sogenannten Alzheimer-Mäuse, in denen eine typische mutierte Form des β-Amyloids (β-Amyloid-Peptid) unter der Kontrolle des PDNF-Promotors eingeführt wurde, oder für familiäre amyotrophe Lateralsklerose (ALS), in denen ein Minigen der im Menschen mutierten Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) in das Genom integriert wurde. Solche Tiermodelle bieten Möglichkeiten, den Verlauf der Krankheit zu analysieren und mögliche Therapieansätze auszuarbeiten. Mögliche Einschränkungen dieser genetischen Ansätze sind z.B. zu breite Expression der eingeführten genetischen Veränderungen oder unerwünschte Nebeneffekte; es wird versucht, diese in der zweiten Generation genetisch veränderter Mäuse zu umgehen. Die unterschiedlichen Strategien, Mutationen im Genom zu etablieren, werden in binären Systemen kombiniert. Auf diese Weise wird erreicht, daß Mutationen basierend auf homologer Rekombination gewebespezifisch eingeführt (Cre/loxP-System) und/oder temporär reguliert werden können (tetOn/Off-System,siehe Zusatzinfo ).

D.F./J.M.

transgene Mäuse

schematische Darstellung der Herstellung einer knock-out Maus

transgene Mäuse

Binäre Technologien zur Erzeugung von Mausmutationen:
Binäre Systeme benötigen die Kombination von zwei unterschiedlichen Mauslinien (daher binär) zur Erzeugung einer neuen Mutation. Dazu gehören das Tetracyclin-regulierte Transaktivatorsystem tetOn/Off zur Erzeugung temporär und regional begrenzter Mausmutationen und das Cre-loxP System zur Erzeugung gezielter gewebespezifischer Mausmutanten.
1)tetOn/Off-System(Tetracyclin-reguliertes System). Im Genom von Maus 1 wird das Transgen unter der Kontrolle des tetO-Promotors integriert. Zur Aktivierung dieses Promotors wird ein zusätzlicher Transkriptionsfaktor (tTA oder rtTA) benötigt. Maus 2 exprimiert diesen Transkriptionsfaktor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Nachkommen aus Kreuzungen von Maus 1 mit Maus 2 tragen sowohl das tetO-Transgen als auch das Gen des aktivierenden Transkriptionsfaktors in ihrem Genom. Nur in den Zellen des Organismus, die auch diesen exprimieren, kann die Transkription des Transgens unter tetO-Kontrolle aktiviert werden. – Im tetOff-System interagiert der Transkriptionsfaktor tTA spontan mit tetO. Tetracyclin, das der Maus oral verabreicht wird, inhibiert die tTA-tetO Wechselwirkung und unterdrückt so die Expression des nachfolgenden Gens. Zwischen Tetracyclinaufnahme und der Abschaltung der Transgenexpression liegen nur einige Tage. Das tetOn-System ist funktionell ähnlich. Statt dem Transkriptionsfaktor tTA wird rtTA exprimiert. rtTA interagiert nur mit dem tetO-Promotor bei gleichzeitiger Bindung von Tetracyclin an rtTA. Mit Hilfe des tetOn-Systems kann die Expression eines Transgens durch orale Aufnahme von Tetracyclin zu jedem beliebigen Zeitpunkt während oder nach der Entwicklung der Maus induziert werden. Mit großem Erfolg wurde dieses System bei der genetischen Analyse von Mechanismen zur Bildung von Gedächtnis angewandt. Durch die zeitlich beschränktere (tetOff) Expression einer dominant aktiven Form von Calcium-Calmodulin-abhängiger Proteinkinase II konnte dieses Molekül als Schlüsselmolekül in der Übertragung synaptischer Plastizität und Ausbildung von Erinnerung identifiziert werden.
2) Cre-loxP-System. Das Prinzip des Systems beruht darauf, daß Cre-Rekombinase die Deletion von DNA, die von loxP-Sequenzen flankiert ist, induziert. Um Cre-loxP-induzierte Gendeletion in Mäusen zu erreichen, werden wieder zwei Mauslinien hergestellt. Maus 1 exprimiert unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors Cre-Rekombinase; besonderer Wert wird dabei auf das Expressionsmuster des Transgens gelegt. In Maus 2 werden mittels homologer Rekombination loxP-Sequenzen eingeführt, die das auszuschaltende Gen flankieren. Weder die Cre-Expression noch die Einführung der loxP-Sequenzen allein induziert einen Phänotyp in der jeweiligen Maus. Erst durch Kreuzen der beiden Mauslinien entstehen Nachkommen, die sowohl ein von loxP-Sequenzen flankiertes Zielgen, als auch das ins Genom integrierte Cre-Transgen tragen. Nur in den Zellen des Organismus, welche die Cre-Rekombinase exprimieren, findet die Deletion des loxP-flankierten Gens statt. Auf diese Weise wird die Gewebespezifität der Mutation abhängig vom Expressionsmuster der Cre-Rekombinase erreicht. Ein wichtiges Beispiel aus der Neurobiologie für diese ausgefeilte Transgentechnik ist die auf die CA1-Region des Hippocampus beschränkte knock-out Maus des NMDA-Rezeptors 1 (Glutamatrezeptoren). Der vollständige Verlust der Langzeitpotenzierung und die erheblichen Defekte in der räumlichen Erinnerung, die durch die Mutation hervorgerufen werden, stützen die Hypothese, daß die Schaffer-Kollateralen im Hippocampus essentiell sind für Erinnerung und Gedächtnis.