Viele therapeutische Proteine stammen aus tierischen Zellkulturen. Der menschliche Organismus benötigt Proteine nicht nur als "Baumaterial" für Gewebe und Organe, auch zahlreiche Stoffwechselvorgänge werden von ihnen gesteuert: Hormone regulieren Körperfunktionen, und ohne Antikörper wären wir jedem Krankheitserreger hilflos ausgeliefert. Die biotechnologische Herstellung solcher Proteine und deren Einsatz in medizinischen Therapien ist schon weit verbreitet. Das bekannteste Beispiel ist die Produktion von humanem Insulin mit dem Bakterium Escherichia coli. Allerdings sind viele dieser Proteine sogenannte Glykoproteine, das heißt sie tragen auf ihrer Oberfläche komplizierte Zuckerstrukturen, die für ihre physiologische Funktion von entscheidender Bedeutung sind. Mikroorganismen sind aber nicht in der Lage, diese wichtigen Strukturen tierischer Proteine korrekt aufzubauen. Seit einigen Jahrzehnten ist es möglich, tierische Zellen in Bioreaktoren zu kultivieren und diese zur Gewinnung humaner Proteine einzusetzen. So werden zum Beispiel ein Medikament gegen die Bluterkrankheit – hier fehlt der Blutgerinnungsfaktor VIII – und für Dialysepatienten das Medikament Erythropoietin mit Zellen hergestellt, die aus den Eierstöcken des Chinesischen Hamsters stammen. Diese CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) sind als Zellinien verfügbar und lassen sich nach gentechnischer Veränderung sehr gut zur Produktion der verschiedensten Proteine einsetzen.

Der medizinische Hintergrund


Bei einer lokalen Infektion, zum Beispiel infolge einer Verletzung, dringen Krankheitserreger in das die Wunde umgebende Gewebe ein und lösen dort eine Reaktion des Organismus, die sogenannte Immunantwort, aus. Von immunologisch aktiven Zellen werden in dieser Körperregion Hormone (zum Beispiel Tumor-Nekrose-Faktor a) ausgeschüttet (exprimiert), welche die Endothelzellen (die Zellschicht an der Innenfläche) der Blutgefäße aktivieren. Diese exprimieren spezielle Proteine, sogenannte P-Selektine, die zu einer Anhaftung (Adhäsion) immunologisch aktiver Zellen führen. In der infizierten Region werden dann Leukozyten, Makrophagen und Lymphozyten aus dem Blut ins Gewebe geschleust, um die eingedrungenen Erreger abzuwehren. Die Symptome einer derartigen Entzündung sind eine lokale Erhöhung der Körpertemperatur sowie eine Rötung des infizierten Bereiches. Dringen die Krankheitserreger jedoch in großer Zahl in das Blutgefäßsystem ein, werden die Endothelzellen des gesamten Blutkreislaufes aktiviert. Statt den Erreger im Blut zu bekämpfen, werden massenhaft immunologisch aktive Zellen aus dem Blut ausgeschleust. Als Folge hiervon ist ein septischer Schock nicht auszuschließen, bei dem unter anderem die Körpertemperatur sehr schnell auf tödliche Werte ansteigen kann. In diese Fehlregulation der Immunantwort sollen die von uns synthetisierten Glykoproteine eingreifen. Dazu werden die Gegenspieler der P-Selektine, die P-Selektin-Liganden, biotechnologisch hergestellt. Diese Liganden sitzen auf der Oberfläche der Leukozyten und sind durch ihre Wechselwirkung mit den P-Selektinen für die Adhäsion der Leukozyten an den aktivierten Endothelzellen notwendig. Werden diese Liganden in den Blutkreislauf injiziert, so werden die P-Selektine blockiert und die Ausschleusung von Zellen aus dem Blutkreislauf behindert.

Die Struktur des P-Selektin-Liganden ist bekannt. Auf dem "Rückgrat" des Proteins, der Aminosäurekette, sind an einer Aminosäure fünf Zuckermoleküle (und zwar Fukose, Galaktose, N-Acetyl-Galaktosamin, N-Glukosamin und Neuraminsäure) in einer bestimmten Konfiguration angeordnet. Um die Erfolgsaussichten unseres Projektes zu verbessern, haben wir zwei verschiedene Strategien verfolgt: Im Falle des In-vitro-Wegs, außerhalb des lebenden Organismus, wird die Zuckerstruktur auf einem Peptid von speziellen Enzymen, den Glykosyltransferasen, aufgebaut. Die meisten der dazu benötigten Enzyme sind kommerziell nicht erhältlich. Sie müssen biotechnologisch hergestellt werden. Hierzu wird die genetische Information für eine humane Glykosyltransferase in eine CHO-Zelle eingeschleust. Das Gen für die Glykosyltransferase wird dabei an eine Signalsequenz gekoppelt, welche die Zelle zum Absondern der Transferase veranlaßt. Jene Zellen werden dann vermehrt und in Zellkulturen zur Produktion von Glykosyltransferasen eingesetzt. Im nächsten Schritt werden die so gewonnenen Enzyme dazu benutzt, die Zuckerstruktur des P-Selektin-Liganden aufzubauen. Abschließend kann mit Hilfe der Massenspektrometrie die korrekte Anordnung der Zuckermoleküle überprüft werden.

Auf dem In-vivo-Weg, innerhalb der lebenden Zelle, werden die genetischen Informationen für verschiedene humane Glykosyltransferasen und die genetische Information für das zu glykosylierende Protein in eine einzige CHO-Zelle eingeschleust. Die Gene der Glykosyltransferasen werden jedoch diesmal nicht mit einer Signalsequenz versehen. Dadurch werden die Transferasen im Golgi-Apparat, einem Zellorganell (das für die Kondensation und Umhüllung von Sekreten verantwortlich ist), lokalisiert. Das Gen für das Protein bekommt aber eine Signalsequenz vorgeschaltet. Somit wird es zur Ausschleusung "vorprogrammiert", und beim Weg aus der Zelle passiert es den Golgi-Apparat. Hier warten schon die Glykosyltransferasen, um die Zuckermoleküle auf das Protein zu übertragen. Der Vorteil dieser Strategie ist, daß die Zelle hierbei einen biologisch aktiven P-Selektin-Liganden absondert. Die Schwierigkeit besteht allerdings darin, diese verschiedenen Glykosyltransferasen im richtigen Verhältnis zueinander im Golgi-Apparat anzuordnen.


Die Forschungsergebnisse



Auf dem In-vitro-Weg ist es uns gelungen, fünf verschiedene Glykosyltransferasen biotechnologisch herzustellen. Mit diesen Enzymen synthetisierten wir eine Zuckerstruktur, die der Zielstruktur sehr ähnlich ist. Nur ein einziges Zuckermolekül muß noch angefügt werden – und die dazu benötigte Glykosyltransferase ist kommerziell erhältlich. Auf dem In-vivo-Weg sollte eine Zellinie hergestellt werden, welche den humanen P-Selektin-Liganden in biologisch aktiver Form exprimiert. Nach zwei Jahren gentechnischer Forschungsarbeit haben wir heute mehrere Zellinien zur Verfügung, die diese Anforderung erfüllen. Mit der Produktion unseres Zielproteins in Bioreaktoren wurde bereits begonnen.

Durch die hervorragende Zusammenarbeit von Forschungsgruppen aus fünf europäischen Ländern gelang es, das europaweit verteilte biotechnologische Wissen zu bündeln und das Projektziel zu erreichen. Beteiligt waren außer dem Institut für Biotechnologie des Forschungszentrums Jülich das Institut für Physiologie der Universität Zürich, die Schule für Zahnmedizin der Universität Kopenhagen, das Institut für Enzymtechnik der Universität Düsseldorf, die Abteilung für Bioorganische Chemie der Universität Utrecht und das Institut für Glykobiologie der Universität Oxford. Gemeinsam haben wir erste erfolgreiche Schritte unternommen, ein Protein von hohem therapeutischen Interesse verfügbar zu machen. Wie hoch dieses Interesse ist, zeigen folgende Zahlen: Von den 350 gentechnisch hergestellten Medikamenten, die in den USA zur Zeit klinisch geprüft werden, sind allein zehn für die Behandlung septischer Symptome bestimmt.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 2 / 1999, Seite 913
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