Die erste vollständige Entschlüsselung des Erbguts eines Archaebakteriums, des Methanbildners Methanococcus jannaschii, hat eine Fülle neuer Erkenntnisse und Vergleichsmöglichkeiten zwischen den drei Urreichen des Lebens erbracht (Spektrum der Wissenschaft, November 1996, Seiten 32 bis 34). Außerdem aber bescherte sie einer erst jüngst entdeckten exotischen Klasse von Eiweißstoffen, die bisher nur einem kleinen Kreis von Spezialisten bekannt war, beträchtlichen Zuwachs: den Inteinen. Die Zahl der Gene, die solche selbst-spleißenden Proteine codieren, hat sich dabei mit einem Schlag mehr als verdoppelt – von 10 auf 24 ("Science" Band 273, Seiten 1066 bis 1073, 1996).

Was aber sind Inteine? Der Name (und, wie wir sehen werden, noch einiges mehr) ist als Analogie zu den in Nucleinsäuren seit 1977 bekannten Introns zu verstehen. Dabei handelt es sich um vermutlich unnütze DNA- oder RNA-Abschnitte, welche die sinntragenden (codierenden) Bereiche (Exons) in den kettenförmigen Erbsubstanzmolekülen unterbrechen. Wie Arthur J. Zaug und Thomas R. Cech von der Universität von Colorado in Boulder bereits 1980 herausfanden, sind gewisse RNA-Introns fähig, sich selbst aus der RNA-Kette herauszuschneiden und die beiden Enden des Reststrangs miteinander zu verbinden. Da diese Selbstspleiß-Prozesse zugleich das erste Beispiel für enzymartige Aktivitäten in RNA-Molekülen waren, wurden sie sehr umfassend untersucht und beschrieben (Spektrum der Wissenschaft, Januar 1987, Seiten 42 bis 51), und Cech erhielt für ihre Entdeckung 1989 den Nobelpreis für Chemie.

Analog zu den Introns sind Inteine fähig, sich selbst aus einem Vorläuferprotein herauszuschneiden und die Enden der flankierenden Abschnitte (entsprechend Exteine genannt) zu verbinden. Dieser Vorgang wurde allerdings erst 1990 entdeckt und nicht annähernd so stark beachtet wie das RNA-Spleißen. Obwohl heute die meisten bekannten Beispiele für Inteine aus dem Urreich der als exzentrisch bekannten Archaebakterien stammen, wurde der Prototyp in einem umfassend erforschten Organismus entdeckt, welcher der Menschheit schon seit Jahrtausenden dienstbar ist: der Bierhefe Saccharomyces cerevisiae. Tom H. Stevens und seine Mitarbeiter an der Universität von Oregon in Eugene beobachteten, daß das TFP1-Gen der Hefe offenbar zwei Proteinprodukte codiert, wobei das kleinere in der Mitte des Gens verschlüsselt ist und von den Sequenzen für die beiden Hälften des größeren flankiert wird (Bild 1).

Diese Tatsache allein wäre zwar nichts Besonderes gewesen: Man kennt viele Beispiele sich überlappender oder ineinandergeschachtelter Gene. Ungewöhnlich war jedoch, daß statt der in diesem Falle zu erwarteten zwei Boten-RNAs – eine für jedes Protein – nur eine einzige auftrat, deren Länge der Summe der beiden Proteinprodukte entsprach. (Von einem Gen auf der DNA wird üblicherweise zunächst eine Boten-RNA als Abschrift erzeugt und diese dann in das zugehörige Protein übersetzt – die beiden Vorgänge heißen Transkription und Translation.)

Stevens Gruppe vermutete deshalb, daß nicht, wie sonst üblich, bereits die RNA-Abschrift des Gens zerschnitten und neu zusammengefügt wird. Vielmehr sollte sie zunächst als Ganzes in das Doppelprotein übersetzt und aus diesem erst nachträglich die eine Komponente herausgetrennt werden.

Um dies zu überprüfen, erzeugten die Forscher in dem mittleren Bereich der Boten-RNA Mutationen, die eine Verschiebung des Leserahmens bewirkten. Dies läuft darauf hinaus, daß die Buchstaben des genetischen Alphabets falsch zu Worten (aus jeweils drei Buchstaben) zusammengefaßt werden, und hat einen ähnlichen Effekt, wie wenn man in einem schriftlichen Text ab einer bestimmten Stelle jeweils den letzten Buchstaben eines Wortes an den Anfang des nächsten Wortes verschieben würde: Nicht nur an der mutierten Stelle selbst, sondern im gesamten nachfolgenden Abschnitt wird die genetische Botschaft bei der Translation falsch interpretiert.

Wäre nun die Boten-RNA gespleißt worden, hätte sich diese Rahmenverschiebung nur auf das dabei herausgetrennte Intron ausgewirkt; denn ab der Schnittstelle, die durch eine bestimmte, von der Mutation unberührte Buchstabenfolge gekennzeichnet ist, hätte der Leserahmen wieder gestimmt. Demnach wäre nur das im mittleren Abschnitt codierte Protein verfälscht worden, das in den äußeren Bereichen verschlüsselte dagegen nicht. Tatsächlich aber waren beide Proteine von der Rahmenverschiebung betroffen. (Bei der Mutation mußte man selbstverständlich darauf achten, daß sie die Selbstspleißfähigkeit nicht zerstörte.)

Den Forschern gelang es allerdings nicht, das ungespaltene Protein zu isolieren. Sie vermuteten deshalb, daß die sich heraustrennende Komponente dieses Ausschneiden autokatalytisch beschleunige. Der Vorgang liefe dann so schnell ab, daß keine Chance bestünde, das ursprüngliche Eiweißprodukt zu fassen.

Diese Möglichkeit eröffnete erst die Entdeckung mehrerer Inteine in extrem hitzeliebenden (hyperthermophilen) Archaebakterien wie Thermococcus litoralis und verschiedenen Pyrococcus-Arten. Francine B. Perler und ihre Mitarbeiter bei der US-Firma New England Biolabs konstruierten um das Intein aus der DNA-Polymerase von Pyrococcus herum ein künstliches Selbstspleiß-System, indem sie das Gen für ein maltose-bindendes Protein (M) als sogenanntes N-Extein davorsetzten (N steht für den Stickstoff der Aminogruppe, mit der alle Proteine beginnen), und ein Paramyosin-Gen (P) als C-Extein dahinter (analog steht das C für den Kohlenstoff der Carboxylgruppe, mit der alle Proteine enden).

Dieses Fusionsgen (MIP) pflanzten sie in das Darmbakterium Escherichia co-li ein, dessen Biosynthese-Maschinerie schon bei Temperaturen zwischen 12 und 32 Grad Celsius das zugehörige Protein herstellte. Bei diesen niedrigen Temperaturen aber lief die Spleißreaktion außerordentlich langsam ab, weil das Intein des hitzeliebenden Archaebakteriums von der Evolution an Temperaturen nahe dem Siedepunkt des Wassers angepaßt ist.

Tatsächlich war der Vorgang so verlangsamt, daß die Forscher das ungespleißte Vorläuferprotein zu reinigen vermochten. Indem sie es anschließend in wäßrigen Lösungen, die lediglich geringe Mengen an Kochsalz und Phosphatpuffer enthielten, langsam erwärmten, konnten sie die in der Hitze einsetzende Spleißreaktion verfolgen. Dabei gelang es ihnen, auch eine Zwischenstufe (MIP*) mit zunächst paradox anmutenden Eigenschaften zu isolieren. So schien sie ein höheres Molekulargewicht als MIP selbst zu haben, da sie langsamer durch ein Elektrophorese-Gel wanderte, und verfügte über gleich zwei Amino-Anfangsstücke. Dies läßt auf ei-ne verzweigte Kettenstruktur schließen, deren Sperrigkeit die Wanderungsgeschwindigkeit verringern sollte. Offenbar hat sich in der Zwischenstufe das N- bereits mit dem C-Extein verknüpft, während an diesem immer noch das Intein hängt.

Für den chemischen Mechanismus der Reaktion gibt es zwar Vorschläge; die endgültige Entscheidung darüber ist aber noch nicht möglich. Zunächst muß vor allem die Art der chemischen Bindung geklärt werden, über die der verschobene Molekülteil M an P gebunden ist. Wenn man die Struktur der verzweigten Zwischenstufe aufgeklärt hat, sollte sich daraus und aus den Erfordernissen an die Aminosäuresequenz des Inteins, die sich aus den Mutationsstudien ergeben haben, der genaue Reaktionsverlauf rekonstruieren lassen.

Eine andere, nicht weniger raffinier-te Methode zur Überlistung der Selbstspleißreaktion entwickelten die Arbeitsgruppen von Christopher Noren bei der Firma New England Biolabs in Beverly (Massachusetts) und Peter Schultz an der Universität von Kalifornien in Berkeley. Sie ersetzten die für die Reaktion unabdingbare Aminosäure Serin in der Startposition des Inteins durch eine Variante, die sich bei Lichteinwirkung in Serin zurückverwandelt. Gegenüber der Temperaturmethode hat dieser photochemische Trick den Vorteil, daß sich die Selbstspleißreaktion mit einer zeitlichen Präzision von Sekundenbruchteilen starten läßt, wenn man das blockierte Vorläufermolekül zum Beispiel einem kurzen Laserlichtblitz aussetzt ("Angewandte Chemie", Band 107, Seiten 1736 bis 1737, 1995).

Außer der Fähigkeit zum Selbstspleißen haben die Inteine mit den Proteinprodukten der RNA-Introns eine weitere Eigentümlichkeit gemeinsam: Sie können wie Endonucleasen wirken, das heißt bestimmte Buchstabenkombinationen in der DNA erkennen und den Erbsubstanz-Doppelstrang an diesen Stellen durchtrennen. Bei den DNA-Abschnitten, auf die sie spezialisiert sind, handelt es sich nun gerade um Exemplare ihres eigenen Ursprungsgens, denen das Mittelstück fehlt, auf dem sie selbst codiert sind. Sie schneiden die DNA an der betreffenden Stelle auf und setzen einen Reparaturmechanismus in Gang, durch den mit einem intron/intein-haltigen Exemplar des Gens als Vorlage das Mittelstück hergestellt und eingefügt wird (Bild 2).

Zwar ließ sich dieser traditionell als intron homing bezeichnete Prozeß bisher nur für vier der bekannten Inteine direkt nachweisen. Sequenzvergleiche erlauben jedoch den Schluß, daß alle Inteine sich zumindest von Endonucleasen ableiten, auch wenn manche die Fähigkeit zum homing inzwischen vielleicht verloren haben. Die sporadische Verteilung von Inteinsequenzen über alle drei Urreiche legt auch nahe, daß es mittels eben dieser Endonuclease-Aktivität horizontale Gentransfers (Übertragungen zwischen verschiedenen Spezies) gegeben hat.

Warum haben selbstspleißende Inteine und Introns diese Funktion als homing-Endonucleasen entwickelt? Nun, die Frage ist falsch herum gestellt. Wenn man sie umdreht, ergibt sich die Antwort fast von selbst. Warum sind homing-Endonucleasen selbstspleißend, sei es auf RNA- oder auf Protein-Ebene? Ein Enzym, das ein Gen zerschneiden und dann seine eigene Erbinformation mitten hineinsetzen kann, ist für die Zelle potentiell tödlich, weil es auf diese Weise über kurz oder lang ein lebenswichtiges Gen zerstört. Wird der Schaden jedoch auf RNA- oder auf Protein-Ebene repariert, indem die eingefügte Sequenz sich selbst herausschneidet, kommt am Ende wieder das richtige Produkt heraus.

Die Intein- oder Intron-Aktivität ist also die Bedingung, die eine bestimmte Art von mobilen genetischen Elementen erfüllen muß, damit sie von der Zelle toleriert werden kann. Wenn nicht, bleibt solchen Elementen nur eine Chance zum Überleben: Sie müssen zugleich die Fähigkeit zur Infektion anderer Zellen erlangen – damit aber sind sie zu Viren geworden. Insofern ist es vermutlich kein Zufall, daß Selbstprozessierung auf Proteinebene auch oft in diesen primitiven Krankheitserregern vorkommt. So ist in der Erbinformation des AIDS-Erregers HIV ein langes Kettenmolekül verschlüsselt, in dem alle Proteine des Virus aneinandergehängt sind. Die in diesem Polyprotein enthaltene HIV-Protease-Aktivität zerlegt das Molekül erst nachträglich in die richtigen Einzelteile.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 2 / 1997, Seite 16
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH