Biophysik: Scharfer Blick ins Eingemachte
Auf den ersten Blick scheint in biologischen Zellen das kreative Chaos zu herrschen. Tausende verschiedener Proteine wirbeln im Inneren durcheinander und finden seltsamerweise doch ihr Ziel. Welches Protein wo zu finden ist, verrät eine neue Mikroskopietechnik mit fast beispielloser Auflösung.
Klein und voller Vielfalt – das ist genau die Kombination, mit der Wissenschaftler ihre Nöte haben. "Klein" bedeutet, dass mit bloßem Auge nicht viel zu holen ist. Um etwas sehen zu können, sind entsprechende Tricks notwendig. Was nicht weiter schlimm wäre, denn immerhin kennen Physiker und Chemiker den Aufbau ihrer Kristalle und Moleküle bis ins winzigste Detail. Wenn da nicht diese unangenehme, typisch biologische Vielfalt wäre.
Denn verglichen mit den relativ eintönigen Proben der Physiker und Chemiker geht es bei den Biologen unerhört bunt zu. Niemand weiß genau, wie viele verschiedene Proteine sich in einer ganz gewöhnlichen Zelle tummeln, aber mit Sicherheit geht die Zahl weit in die Tausende. Und jedes von ihnen liegt in Tausenden von Exemplaren vor. Und das waren nur die Proteine, doch da sind ja noch die Lipide, Kohlenhydrate, Peptide und so weiter. Mit den ausgefeilten Methoden der Chemie und Physik ist diesem Gewusel beim besten Willen nicht beizukommen.
Bleibt das Mikroskop. Wer bei diesem Wort jedoch an das gute alte Linsensystem mit Spiegel und Objektträger aus Schulzeiten denkt, der wird beim Anblick der modernen Forschungsmikroskope leichte Schwierigkeiten mit der Wiedererkennung haben. Was da heutzutage links und rechts angebaut ist, durch den Strahlengang zischt und Photonen zählt, das erinnert beinahe doch an die Apparate aus physikalischen Laboratorien. Welch Wunder – längst hat die Physik sich mit der Biologie verbündet, um Vielfalt und Präzision im Mikroskop allen Schwierigkeiten zum Trotz unter ein Deckglas zu bringen.
Den neuesten Erfolg in diesem steten Bemühen vermelden nun US-amerikanische Wissenschaftler um Eric Betzig vom Howard Hughes Medical Institute. Ihr Rezept agiert unter dem Namen PhotoActivated Localization Microscopy, kurz PALM, und ist so eine Art supergenaues fotografisches Ortungssystem für einzelne Proteinsorten im Schein-Chaos des Zellinneren. Was nur klappt, weil Laser das Licht liefern und anstelle des Menschen der Computer mit empfindlichen Sensoren durch die Optik schaut.
Um ein bestimmtes Protein mit PALM aufzuspüren, sind allerdings einige molekularbiologische Vorarbeiten nötig. Genau genommen sieht das Mikroskop nämlich nicht dieses Zielprotein, sondern ein anderes, das im richtigen Licht fluoresziert. Damit dieses Fluoreszenzmolekül aber dennoch den Ort des Zielproteins verraten kann, müssen die beiden miteinander verschmolzen werden. Auf Ebene der Proteine wäre das schwerlich machbar, dafür manipuliert man besser an den Genen herum und hängt den Bauplan für den Fluoreszenzmarker direkt an jenen des Zielobjekts. Benötigt die Zelle ihr Protein, bastelt sie sich nach dieser verwanzten Anleitung eine größere Version, die an einem Ende leuchten kann. Und schon kann PALM sich für seine Spähdienste warmlaufen.
Die Zelle erleidet zuvor noch schnell die üblichen Prozeduren für hochauflösende Mikroskopie: Sie wird schockgefroren, damit sich nichts mehr bewegt oder verformt, und bei Bedarf in dünne Scheibchen geschnitten. Als fertiges Präparat kommt sie sodann in den Strahlengang und darf sich hier kurz verschnaufen, denn zunächst benötigt PALM eine dunkle Referenz. Gewissermaßen die Ruhe vor dem Blitzgewitter.
Richtig los geht es, sobald der Laser in Aktion tritt. Mit ständigen Lichtpulsen regt er die Fluoreszenzstoffe an den Proteinen an. Diese schlucken die Energie und geben sie kurz darauf in leicht dezimierter Form als langwelligeres Fluoreszenzlicht wieder ab. Ein hochempfindlicher Sensor, dem bereits einzelne Photonen ausreichen, registriert das Licht und leitet die Information weiter an einen angeschlossenen Computer mit Spezialsoftware.
Soweit wäre die Prozedur nichts Neues. Doch PALM ist fleißig. Bis zu einigen hunderttausend Einzelbilder sammelt das System, auf denen mal dieses und mal jenes Protein aufleuchten. Die Software prognostiziert anhand der verschmierten Leuchtpünktchen, wo genau vermutlich das Protein sitzt und wie sein Abbild aussehen würde, wenn es zufälligen Schwankungen durch die physikalischen Eigenschaften der Optik und des Lichtes unterworfen wäre. So entsteht eine Karte der Aufenthaltswahrscheinlichkeitsdichte, die umso mehr Proteine umfasst, je mehr Einzelbilder in die Berechnungen einfließen. Und da die verschmierten Fluoreszenzflecken zu akkuraten Punkten werden, steigt die Auflösung in selten erreichte Regionen. Bis zu wenige Nanometer dürfen die Proteine beieinander sitzen, bevor PALM sie nicht mehr als getrennte Objekte unterscheiden kann.
Dass diese Methode in der Tat praxistauglich ist, haben Betig und seine Kollegen auch gleich an mehreren Beispielen demonstriert. So untersuchten sie die Verteilung von Proteinen in den Membranen von Lysosomen, Mitochondrien und dem Cytoplasma. Membrangebundene Proteine bieten sich für solche Untersuchungen besonders an, da sie schon weit gehend fixiert sind und nach dem Gefrieren praktisch an ihrem Ort festgenagelt sind. Würde man sie unter verschiedenen Blickwinkeln beleuchten und vermessen, könnte PALM sogar eine dreidimensionale Karte ihrer Verteilung erstellen. Zugegeben: Das ist Zukunftsmusik, doch die Wissenschaftler arbeiten bereits an solchen Plänen.
Bei aller Freude an den schön aufgelösten Bildern hat PALM aber mit einer Reihe von Schwachpunkten zu kämpfen. So lassen sich nur jene Proteine lokalisieren, die sich bereitwillig mit einem Fluoreszenzprotein verkuppeln lassen und dabei weder ihre Form verlieren, noch ihre Funktion einstellen oder einfach an einen anderen Ort wandern. Außerdem ist PALM nichts für lebende Zellen. Zwischen zwei und zwölf Stunden dauert es, einen vollständigen Satz von Einzelbildern auszunehmen – so lange hält keine Zelle still. Aber auch da tüfteln die Forscher schon an schnelleren Varianten.
Der Blick ins Schein-Chaos wird mit PALM also wieder ein gutes Stück schärfer. Auch wenn – oder gerade weil die neue Mikroskopietechnik noch an vielen Stellen zu verbessern ist, dürfen wir mit Spannung erwarten, welche Einsichten sie uns bescheren wird. Und welche Tricks die Biologen sich als nächstes bei den Physikern abschauen werden. Genug Vielfalt zum Beobachten bieten Zellen uns allemale.
Denn verglichen mit den relativ eintönigen Proben der Physiker und Chemiker geht es bei den Biologen unerhört bunt zu. Niemand weiß genau, wie viele verschiedene Proteine sich in einer ganz gewöhnlichen Zelle tummeln, aber mit Sicherheit geht die Zahl weit in die Tausende. Und jedes von ihnen liegt in Tausenden von Exemplaren vor. Und das waren nur die Proteine, doch da sind ja noch die Lipide, Kohlenhydrate, Peptide und so weiter. Mit den ausgefeilten Methoden der Chemie und Physik ist diesem Gewusel beim besten Willen nicht beizukommen.
Bleibt das Mikroskop. Wer bei diesem Wort jedoch an das gute alte Linsensystem mit Spiegel und Objektträger aus Schulzeiten denkt, der wird beim Anblick der modernen Forschungsmikroskope leichte Schwierigkeiten mit der Wiedererkennung haben. Was da heutzutage links und rechts angebaut ist, durch den Strahlengang zischt und Photonen zählt, das erinnert beinahe doch an die Apparate aus physikalischen Laboratorien. Welch Wunder – längst hat die Physik sich mit der Biologie verbündet, um Vielfalt und Präzision im Mikroskop allen Schwierigkeiten zum Trotz unter ein Deckglas zu bringen.
Den neuesten Erfolg in diesem steten Bemühen vermelden nun US-amerikanische Wissenschaftler um Eric Betzig vom Howard Hughes Medical Institute. Ihr Rezept agiert unter dem Namen PhotoActivated Localization Microscopy, kurz PALM, und ist so eine Art supergenaues fotografisches Ortungssystem für einzelne Proteinsorten im Schein-Chaos des Zellinneren. Was nur klappt, weil Laser das Licht liefern und anstelle des Menschen der Computer mit empfindlichen Sensoren durch die Optik schaut.
Um ein bestimmtes Protein mit PALM aufzuspüren, sind allerdings einige molekularbiologische Vorarbeiten nötig. Genau genommen sieht das Mikroskop nämlich nicht dieses Zielprotein, sondern ein anderes, das im richtigen Licht fluoresziert. Damit dieses Fluoreszenzmolekül aber dennoch den Ort des Zielproteins verraten kann, müssen die beiden miteinander verschmolzen werden. Auf Ebene der Proteine wäre das schwerlich machbar, dafür manipuliert man besser an den Genen herum und hängt den Bauplan für den Fluoreszenzmarker direkt an jenen des Zielobjekts. Benötigt die Zelle ihr Protein, bastelt sie sich nach dieser verwanzten Anleitung eine größere Version, die an einem Ende leuchten kann. Und schon kann PALM sich für seine Spähdienste warmlaufen.
Die Zelle erleidet zuvor noch schnell die üblichen Prozeduren für hochauflösende Mikroskopie: Sie wird schockgefroren, damit sich nichts mehr bewegt oder verformt, und bei Bedarf in dünne Scheibchen geschnitten. Als fertiges Präparat kommt sie sodann in den Strahlengang und darf sich hier kurz verschnaufen, denn zunächst benötigt PALM eine dunkle Referenz. Gewissermaßen die Ruhe vor dem Blitzgewitter.
Richtig los geht es, sobald der Laser in Aktion tritt. Mit ständigen Lichtpulsen regt er die Fluoreszenzstoffe an den Proteinen an. Diese schlucken die Energie und geben sie kurz darauf in leicht dezimierter Form als langwelligeres Fluoreszenzlicht wieder ab. Ein hochempfindlicher Sensor, dem bereits einzelne Photonen ausreichen, registriert das Licht und leitet die Information weiter an einen angeschlossenen Computer mit Spezialsoftware.
Soweit wäre die Prozedur nichts Neues. Doch PALM ist fleißig. Bis zu einigen hunderttausend Einzelbilder sammelt das System, auf denen mal dieses und mal jenes Protein aufleuchten. Die Software prognostiziert anhand der verschmierten Leuchtpünktchen, wo genau vermutlich das Protein sitzt und wie sein Abbild aussehen würde, wenn es zufälligen Schwankungen durch die physikalischen Eigenschaften der Optik und des Lichtes unterworfen wäre. So entsteht eine Karte der Aufenthaltswahrscheinlichkeitsdichte, die umso mehr Proteine umfasst, je mehr Einzelbilder in die Berechnungen einfließen. Und da die verschmierten Fluoreszenzflecken zu akkuraten Punkten werden, steigt die Auflösung in selten erreichte Regionen. Bis zu wenige Nanometer dürfen die Proteine beieinander sitzen, bevor PALM sie nicht mehr als getrennte Objekte unterscheiden kann.
Dass diese Methode in der Tat praxistauglich ist, haben Betig und seine Kollegen auch gleich an mehreren Beispielen demonstriert. So untersuchten sie die Verteilung von Proteinen in den Membranen von Lysosomen, Mitochondrien und dem Cytoplasma. Membrangebundene Proteine bieten sich für solche Untersuchungen besonders an, da sie schon weit gehend fixiert sind und nach dem Gefrieren praktisch an ihrem Ort festgenagelt sind. Würde man sie unter verschiedenen Blickwinkeln beleuchten und vermessen, könnte PALM sogar eine dreidimensionale Karte ihrer Verteilung erstellen. Zugegeben: Das ist Zukunftsmusik, doch die Wissenschaftler arbeiten bereits an solchen Plänen.
Bei aller Freude an den schön aufgelösten Bildern hat PALM aber mit einer Reihe von Schwachpunkten zu kämpfen. So lassen sich nur jene Proteine lokalisieren, die sich bereitwillig mit einem Fluoreszenzprotein verkuppeln lassen und dabei weder ihre Form verlieren, noch ihre Funktion einstellen oder einfach an einen anderen Ort wandern. Außerdem ist PALM nichts für lebende Zellen. Zwischen zwei und zwölf Stunden dauert es, einen vollständigen Satz von Einzelbildern auszunehmen – so lange hält keine Zelle still. Aber auch da tüfteln die Forscher schon an schnelleren Varianten.
Der Blick ins Schein-Chaos wird mit PALM also wieder ein gutes Stück schärfer. Auch wenn – oder gerade weil die neue Mikroskopietechnik noch an vielen Stellen zu verbessern ist, dürfen wir mit Spannung erwarten, welche Einsichten sie uns bescheren wird. Und welche Tricks die Biologen sich als nächstes bei den Physikern abschauen werden. Genug Vielfalt zum Beobachten bieten Zellen uns allemale.
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