Stickstofffixierung, ein Prozess, durch den atmosphärischer Stickstoff in Ammoniak überführt wird. Die Aktivierung des molekularen Stickstoffs und dessen Reduktion zu Ammoniak hängt von der katalytischen Aktivität des Enzyms Nitrogenase ab. Der Ammoniak wird anschließend durch den Prozess der Ammoniakassimilation in verschiedene Stickstoffverbindungen der Zelle eingebaut. Die Nitrogenase ist – besonders bei anaeroben Organismen – ein sehr instabiles Enzym. Die S. ist ein fundamental wichtiger Vorgang für die Stickstoffökonomie des Bodens und des Wassers und sie stellt eine essenzielle Stufe des Stickstoffzyklus der Biosphäre dar. Bestimmte freilebende Erdmikroorganismen, insbesondere die Gattungen Clostridium und Azotobacter, verfügen über die Fähigkeit der S. Andere Mikroorganismen fixieren Stickstoff in der Symbiose mit höheren Pflanzen, wie z.B. den Leguminosen. Es sind auch viele Beispiele für die symbiotische Vergesellschaftung zwischen Mikroorganismen und Nichtleguminosenpflanzen bekannt, z.B. wurde ein Actinomycet (Frankia spp.) aus den stickstofffixierenden Wurzelknöllchen der Erle (Alnus) isoliert. Im Wasser, insbesondere im Ozean, sind die wichtigsten Stickstofffixierer die Cyanobakterien. Die S. durch Cyanobakterien ist für den Reisanbau in den Tropen von praktischer Bedeutung. Die Flechten (eine symbiotische Vergesellschaftung zwischen einem Cyanobakterium und einem Pilz) sind von großer ökologischer Bedeutung, weil sie dazu befähigt sind, Standorte zu besiedeln, in denen extreme klimatische Verhältnisse herrschen oder die arm an Nahrungsmitteln sind. Der Kohlenstoff- und Stickstoffbedarf der Flechten wird durch Photosynthese und S. gedeckt. Solche symbiotischen Systeme werden deshalb größtenteils über die Atmosphäre versorgt und ihre Ernährungsanforderungen an die restliche Umgebung sind relativ niedrig. Flechten sind die Erstbesiedler einer unfruchtbaren Umgebung und ebnen den Weg für eine spätere Ansiedlung von Pflanzen, die einen anspruchsvolleren Nahrungsbedarf haben. In armen Böden kann das Nostoc-Gunnera-System ungefähr 70 g atmosphärischen Stickstoff je m² und Jahr fixieren.

Diazotrophie oder die Fähigkeit, S. durchzuführen, ist ein spezielles Charakteristikum relativ weniger prokaryontischer Organismen (Diazotrophe). Sie wurde noch bei keinem Eukaryonten nachgewiesen. Bei Clostridium pasteurianum, das zur Stickstoffanreicherung von Ackerböden beiträgt, werden sowohl die Reduktionskraft als auch das ATP, die für die S. benötigt werden, durch phosphoroklastische Pyruvatspaltung zur Verfügung gestellt. In zellfreien Enzympräparationen kann das Pyruvat durch ATP oder ein ATP-erzeugendes System sowie ein Reduktionsmittel (Wasserstoff oder ein Elektronendonor) ersetzt werden. Zu den geeigneten Reduktionsmitteln zählen Natriumdithionit und Kaliumborohydrid. Die Nitrogenase kann ebenfalls – in Gegenwart einer ferredoxinabhängigen Hydrogenase – Elektronen aus molekularem Wasserstoff auf Stickstoff übertragen. Bei den meisten stickstofffixierenden Systemen ist der natürliche Elektronendonor ein Ferredoxin. In bestimmten Fällen treten an dessen Stelle andere elektronenübertragende Proteine, z.B. Flavodoxin oder Rubredoxin. Für den Transfer eines Elektronenpaars weden vier Moleküle ATP benötigt. Die stufenweise Stickstoffreduktion auf der Oberfläche der Nitrogenase erfolgt möglicherweise über enzymgebundene Intermediate. Freie Zwischenprodukte zwischen Ammoniak (dem Produkt) und N₂ (dem Substrat der S.) wurden nicht beobachtet.

Das am ausgiebigsten untersuchte Sickstofffixierungssystem ist die symbiotische Vergesellschaftung zwischen Mitgliedern der Leguminosae und Rhizobium. Meistens wird für diese Untersuchungen die Leguminose Glycine max (Sojabohne) verwendet. Eine Infektion der Pflanzenwurzeln durch virulente Rhizobien führt zur Bildung von Wurzelknöllchen, die die Fähigkeit besitzen, Stickstoff zu fixieren. Unter Laborbedingungen fixieren auch reine Rhizobium-Kulturen Stickstoff, vorausgesetzt, eine Pentose (z.B. Arabinose) und eine Dicarbonsäure (z.B. Fumarat oder Succinat) sind im Kulturmedium vorhanden. Im Verlauf des Infektionsprozesses verlieren die Rhizobium-Zellen ihre stäbchenähnliche Form und gehen in kugelförmige Bakterioide über. Die Reduktion des Stickstoffs zu Ammoniak und die Assimilation des Ammoniaks laufen in diesen Bakterioiden ab. Die Kohlenstoffverbindungen für die Atmung der Bakterioide und für die Ammoniakassimilation werden von den Pflanzen zur Verfügung gestellt. Die Aminosäuren werden zu den Wirtspflanzengeweben exportiert. Für die S. durch Leguminosen in Wurzelknöllchen wird Leghämoglobin benötigt und die Leghämoglobinkonzentration ist eine Kennzahl für die Stickstofffixierungsfähigkeit. Leghämoglobin kommt in Stickstofffixierungssystemen von Nichtleguminosen nicht vor. Innerhalb der Zellen der Wurzelknöllchen tauchen die Bakterioide in eine Lösung von Leghämoglobin ein, die von einer Membranhülle umschlossen ist. Die Transportgeschwindigkeit des Sauerstoffs durch eine ungerührte Leghämoglobinlösung ist achtmal höher als dessen Diffusionsgeschwindigkeit durch Wasser. Diese erleichterte Sauerstoffdiffusion zu den Bakterioiden ermöglicht eine hohe Atmungsgeschwindigkeit, die notwendig ist, um die relativ großen Mengen an ATP zu produzieren, die von der Nitrogenase benötigt werden. Im Gegensatz dazu, stört Sauerstoff während der Laborpräparation aktiver Bakterioide, weil im Wirtspflanzengewebe Phenole und Polyphenol-Oxidasen vorhanden sind. Diese können durch Adsorption an Polyvinylpyrrolidon in Gegenwart von Ascorbinsäure inaktiviert werden. Die stickstofffixierende Bakterioidsuspension kann aus homogenisierten Wurzelknöllchen unter streng anaeroben Bedingungen isoliert werden, z.B. durch Zentrifugieren des Homogenats unter Argon oder durch Zerstören der Polyphenol-Oxidase-Aktivität. Die Bakterioide können dann wie jede andere Bakterienquelle für Nitrogenase behandelt werden. Der anschließende Zellaufschluss und die Enzymreinigung durch selektive Präzipitation und Säulenchromatographie müssen unter streng anaeroben Bedingungen durchgeführt werden, weil die Nitrogenase durch Sauerstoff irreversibel inaktiviert wird. Dies ist besonders bei späteren Reinigungsstufen kritisch, weil die Sauerstoffempfindlichkeit der Nitrogenase im Verlauf der Reinigung zunimmt. Die getrennten Proteinkomponenten der Nitrogenase werden beide durch Sauerstoff inaktiviert, wobei das Fe-Protein am empfindlichsten reagiert.