Thymidylat-Synthase (EC 2.1.1.45), das die Synthese von Desoxythymidylat (dTMP) durch Methylierung von Desoxyuridylat (dUMP) katalysierende Enzym, wobei N⁵,N¹⁰-Methylentetrahydrofolat (N⁵,N¹⁰-FH₄) als Donor der Methylgruppe fungiert (aktive Einkohlenstoff-Einheiten, Pyrimidinbiosynthese). Die T. ist ein hochkonserviertes Dimer (M_r 70 kDa). Die SH-Gruppe von Cys¹⁹⁸ greift das C6-Atom von dUMP unter Ausbildung eines kovalenten Addukts nucleophil an. Das resultierende enzymgebundene Enolat bildet mit dem Iminium-Kation des N⁵,N¹⁰-FH₄ einen ternären kovalenten Enzym-dUMP-FH₄-Komplex, der schließlich unter Produktbildung und Freisetzung von Dihydrofolat sowie Regenerierung des Enzyms zerfällt. Das Dihydrofolat wird in einer NADPH-abhängigen Reaktion durch die Dihydrofolat-Reduktase wieder zu N⁵,N¹⁰-FH₄ regeneriert. Die T. wird durch Selbstmord-Inhibitoren gehemmt und ist wie die Dihydrofolat-Reduktase ein wichtiger Angriffspunkt der Krebschemotherapie.