Lexikon der Biologie: optischer Test
optischer Test, optischer Enzymtest, Methode zur Bestimmung von Enzymaktivitäten. Man unterscheidet ( vgl. Abb. ): 1) Zweipunktbestimmung. Bei diesem diskontinuierlichen Verfahren wird dem zu bestimmenden Enzym dessen spezifisches Substrat zugesetzt. Die Konzentration des Substrats oder des Produkts wird zum Zeitpunkt 0 und nach einer festgelegten Inkubationszeit photometrisch (Photometrie) bestimmt. Bei dieser Methode kann der Reaktionsverlauf nur ungenügend verfolgt werden. Bei schnell ablaufenden Reaktionen wird die Aktivität des Enzyms zu niedrig bestimmt. 2) Endpunktverfahren. Bei diesem diskontinuierlichen Verfahren wird dem zu bestimmenden Enzym eine bestimmte Menge seines spezifischen Substrats zugesetzt. Man bestimmt die Zeit, die benötigt wird, bis das gesamte Substrat umgesetzt ist. Bei diesem Verfahren kann die echte Enzymaktivität nicht festgestellt werden, da nicht während der ganzen Reaktionszeit unter Substratsättigung gearbeitet wird. Mit dieser Methode läßt sich auch bei bekannter Konzentration des zugesetzten Enzyms eine unbekannte Substratkonzentration bestimmen. Wichtig ist, daß die Reaktion vollständig abläuft, d.h., daß die zu bestimmende Substanz vollständig umgesetzt wird. 3) kinetische Methode. Bei diesem kontinuierlichen Verfahren, das 1936 von O.H. Warburg eingeführt wurde, wird dem zu bestimmenden Enzym dessen spezifisches Substrat zugesetzt. Gemessen wird entweder die Konzentrationszunahme des Produkts oder die Konzentrationsabnahme des Substrats pro Zeiteinheit. Der Test läuft bei Substratsättigung ab, da nur unter diesen Bedingungen die Konzentrationsänderung des Produkts oder des Substrats der Enzymaktivität proportional ist. Je mehr Substrat pro Zeiteinheit umgesetzt wird, desto höher ist die Enzymaktivität in der Probe. Mit Hilfe der spezifischen Enzymaktivität kann die Konzentration des Enzyms im Testansatz bestimmt werden. Bei der kinetischen Methode unterscheidet man 2 Typen: a) direkte Methode oder einfacher optischer Test. Gemessen wird die Abnahme der Extinktion (Lambert-Beersches Gesetz) bei Abnahme der Konzentration eines Substrats oder Cosubstrats (z.B. Nicotinamidadenindinucleotid [Abb.]), das eine Absorption im meßbaren Bereich zeigt, oder die Extinktionszunahme bei Zunahme des Produkts (z.B. Bestimmung der Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase). b) indirekte Methode, zusammengesetzter optischer Test oder gekoppelter optischer Test. Ist die direkte photometrische Messung von Substrat, Cosubstrat und Produkt nicht möglich, so wird an die eigentliche enzymatische Reaktion eine sog. Indikatorreaktion angeschlossen (z.B. Bestimmung der Enzymaktivität der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase), in der das Produkt durch eine chemische Reaktion in ein farbiges Derivat umgesetzt wird. Ist eine direkte Umsetzung nicht möglich, wird eine Hilfsreaktion zwischengeschaltet (z.B. Bestimmung der Enzymaktivität der Kreatinkinase; CK/GOT-Quotient). Wichtig bei dieser Methode ist, daß die enzymatische Reaktion, die gemessen werden soll, den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt darstellt. Enzymmuster.
S.G.
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optischer Test
1 Zweipunktbestimmung; 2 Endpunktverfahren; 3 kinetische Methode: a direkte Methode (einfacher optischer Test) mit abnehmender Extinktion (z.B. Aktivitätsmessung der Lactat-Dehydrogenase [LDH]); b direkte Methode mit zunehmender Extinktion (z.B. Aktivitätsmessung der alkalischen Phosphatase [AP]), c indirekte Methode (zusammengesetzter oder gekoppelter optischer Test) mit Indikatorreaktion (z.B. Aktivitätsmessung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase [GOT] unter Mithilfe der Malat-Dehydrogenase [MDH]), d indirekte Methode mit Indikator- und Hilfsreaktion (z.B. Aktivitätsmessung der Kreatinkinase [CK] unter Mithilfe der Hexokinase [HK] und der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase [GPDH]).
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