Oxygenasen, katalysieren im Gegensatz zu Oxidasen Oxidationen, bei denen Sauerstoffatome direkt in das Substratmolekül eingebaut werden, wobei beispielsweise eine neue Hydroxygruppe oder Carboxygruppe gebildet wird. Je nachdem, ob nur ein Sauerstoffatom oder beide in das Substrat eingebaut werden, unterteilt man die O. in Monooxygenasen bzw. Dioxygenasen.

Da das zweite Sauerstoffatom zu Wasser reduziert werden muss, benötigen die Monooxygenasen ein zweites Substrat als Elektronendonor, so dass sie auch als mischfunktionelle Oxygenasen bezeichnet werden.

Flavoprotein-Hydroxylasen kommen primär in Bakterien vor. Beispielsweise wurde die 4-Hydroxybenzoat-Hydroxylase aus vier verschiedenen Pseudomonas-Arten kristallisiert. Die prosthetische Gruppe ist FAD und die Hydroxylierung des Substrats zu 3,4-Dihydroxybenzoat ist mit der Oxidation von NADPH gekoppelt. Pteridinabhängige Hydroxylasen stellen eine Klasse an Monooxygenasen dar, die Pteridin als prosthetische Gruppe enthalten, wie z.B. die L-Phenylalanin-4-Monooxygenase, die Tyrosin-3-Monooxygenase des Nebennierenmarks und die Tryptophan-5-Monooxygenase des Gehirns.

Hämgekoppelte Monooxygenasen enthalten Cytochrom P450 (Monooxygenasen). Ein Cytochrom-P450-System, das für die Hydroxylierung von Campher verantwortlich ist, wurde aus Pseudomonas putida isoliert und heißt Putidaredoxin (eine 5-exo-Hydroxylase). Es enthält FAD, ein Fe₂S₂Cys₄-Zentrum und ein P450-Cytochrom; die Substrathydroxylierung ist mit der Oxidation von NADPH gekoppelt.

Die für die Hydroxylierung von Prolin- und Lysinresten im Kollagen verantwortlichen Hydroxylasen (2-Oxosäure-Dioxygenasen) enthalten zweiwertiges Eisen und sind spezifisch 2-oxoglutaratabhängig. Letzteres dient als Elektronendonor und wird oxidativ zu Succinat und CO₂ decarboxyliert.

Alle bekannten Dioxygenasen enthalten Eisen entweder in Form von Hämgruppen oder von Fe-S-Zentren. In einigen anderen Enzymen wurde Kupfer gefunden. Beispiele sind die Tryptophan-2,3-Oxygenase, die Homogentisat-Oxidase (L-Phenylalanin) und die 3-Hydroxyanthranilat-Oxidase (L-Tryptophan).

Mono- und Dioxygenasen werden von Bakterien extensiv dafür eingesetzt, aromatische Verbindungen abzubauen und sind deshalb für den Kohlenstoffkreislauf der Biosphäre von fundamentaler Bedeutung.