Lexikon der Biologie: RFLP
RFLP, Abk. für Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (engl. restriction fragment length polymorphism), bezeichnet den Sachverhalt, daß vererbbare, lokal auftretende Sequenzveränderungen in einer DNA zu Veränderungen in dem ursprünglichen Muster von Restriktionsfragmenten bei Verdau dieser DNA mit Restriktionsenzymen führen können. Die Änderungen sind vor allem auf Basenaustauschmutationen in den Erkennungsstellen für die jeweils eingesetzten Enzyme zurückzuführen, es können aber auch Umlagerungen innerhalb der DNA, Insertionen, Deletionen oder Duplikationen zu einem RFLP führen (s.u.). Im Falle einfacher Basenaustausche wird immer dann ein Polymorphismus gefunden, wenn Basen innerhalb einer Erkennungssequenz des gerade benutzten Restriktionsenzyms betroffen sind. Der mit diesen Veränderungen einhergehende Verlust oder das neue Auftreten einer Erkennungssequenz geht bei Spaltung genomischer DNA mit dem Verlust bzw. dem Auftreten eines neuen DNA-Fragments und der Verlängerung oder Verkürzung anderer Fragmente einher. Die Analysen der Änderungen im Spaltungsmuster werden durch vergleichende Gelelektrophoresen durchgeführt. Da durch die Spaltung genomischer DNA eine Vielzahl von Fragmenten entsteht, die mit bloßem Auge nicht voneinander unterschieden werden können, bedient man sich geeigneter Nachweisverfahren für jeweils zu untersuchende Polymorphismen. So kann z.B. durch Anwendung der Southern-Technik (blotting-Techniken) und Einsatz einer spezifischen Sonde für ein bestimmtes Gen (Gensonde), z.B. das β-Globin-Gen (Globin-Gene), ein RFLP für β-Globin-Gene untersucht werden. In den meisten Fällen führen individuelle Sequenzvariationen, die Grundlage der RFLPs, nicht zu phänotypisch erkennbaren Veränderungen des betroffenen Organismus oder gar zu pathologischen Erscheinungen. Sie verhalten sich jedoch bei der Vererbung, da in der Sequenz der DNA verankert, wie normale Gene und können daher als genetische Marker verwendet werden. So kann man anhand von RFLPs auch Verwandtschaftsanalysen durchführen. Liegen die durch Basenaustausch veränderten Sequenzen innerhalb von bekanntermaßen für genetische Defekte verantwortlichen Genen, so zeigt ein RFLP für dieses Gen einen Defekt an. So kann bereits vor der Geburt die DNA eines Kindes darauf analysiert werden (pränatale Diagnostik, genetische Diagnose), ob Sichelzellenhämoglobin (HbS) synthetisiert wird ( vgl. Abb. ). RFLPs eignen sich bei dieser und ähnlichen Analysen besonders gut als genetische Marker, da in heterozygoten Individuen (Heterozygotie) das Auftreten beider Formen eines Gens gleichzeitig nachgewiesen werden kann, ohne daß, wie bei rein phänotypischen Untersuchungen, ein dominantes das rezessive Allel überdeckt. RFLPs können auch eingesetzt werden, um Gene zu untersuchen und zu kartieren (Genkartierung), die nicht von Schnittstellenveränderungen betroffen sind. Hierbei wird versucht, einen Polymorphismus (als RFLP-Marker bezeichnet) zu finden, der immer zusammen mit einem betrachteten Phänotyp bzw. dem zu untersuchenden Gen vererbt wird (Cosegregation). Ausgehend von diesem Ansatz konnten bereits verschiedene Gene für Erbkrankheiten kartiert werden, wie z.B. der Duchenne-Muskeldystrophie (Myopathie). Zudem bietet sich bei dieser Vorgehensweise die Möglichkeit, genetische Defekte nachzuweisen, obwohl das zugrundeliegende Gen noch nicht bekannt ist. Die Suche nach RFLP-Markern wird zunehmend auch in der Züchtungsforschung (Züchtung) eingesetzt, um gezielt mit den Markern gemeinsam vererbte und erwünschte Gene durch klassische Kreuzungsexperimente (Kreuzung) in Zielorganismen einkreuzen und nachweisen zu können. Mit der RFLP-Analyse hat man Genkarten von einigen Nutzpflanzen, wie Mais, Kartoffelpflanze und Tomate, gewonnen, bei denen zuvor nur wenige Genorte auf den Chromosomen bekannt waren. Von besonderem Interesse sind die Gene, die Eigenschaften wie z.B. hohe Erträge steuern. – Einer ebenfalls für diagnostische Zwecke, wie z.B. dem DNA-fingerprinting, einsetzbaren Sonderform der RFLPs liegen die VNTRs (variable number of tandem repeats) zugrunde. Diese gehören zur Satelliten-DNA und bestehen aus einer Vielzahl kurzer Sequenzabschnitte, die als repeats in Tandem-Anordnung vorliegen. Eine sich ändernde Anzahl von Tandem-repeats durch Deletionen und Duplikationen oder auch Insertionen anderer repeats zwischen 2 Erkennungsstellen für ein Restriktionsenzym führt zum Auftauchen eines RFLP aufgrund geänderter Fragmentlängen. RFLP-Kopplungsanalyse.
E.G./S.Kl.
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RFLP
Der mit dem Auftreten des Sichelzellenhämoglobins durch den Austausch einer Aminosäure im Vergleich zum normalen β-Globin einhergehende Basenaustausch auf der Ebene des Gens betrifft gleichzeitig die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym MstII. Das Enzym kann die DNA an dieser Stelle nicht mehr spalten, wodurch ein längeres Fragment entsteht. Durch diesen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) wird das für Sichelzellenhämoglobin codierende Gen nachgewiesen, gleichzeitig wird Homozygotie oder Heterozygotie angezeigt.
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