Restriktionsendonucleasen (EC 3.1.23.1 bis EC 3.1.23.45), eine große Gruppe an Enzymen, die die DNA an spezifischen Sequenzen spalten. Sie besitzen alle unterschiedliche Spezifitäten (Tab.) und kommen in einer großen Vielzahl von prokaryontischen Organismen vor. R. dienen physiologisch zur Spaltung fremder DNA-Moleküle (z.B. Phagen-DNA). Sie erkennen spezifische Palindromsequenzen in Doppelstrang-DNA und sind ein wichtiges Instrument der rekombinanten DNA-Technik. Die Wirts-DNA wird vor der Wirkung der Wirtsrestriktionsendonuclease durch Methylierung (mit Hilfe von S-Adenosyl-L-methionin; Tab.; DNA-Methylierung) geschützt. Der Vorgang, durch den fremde DNA, die in eine prokaryontische Zelle eingeführt wurde, mit Hilfe von R. unwirksam gemacht wird, heißt Restriktion.

In Bakterien wurden zwei Arten an Restriktions-Modifikations-Systemen (R-M-Systemen) gefunden. In Typ-I-Systemen sind die Methylase und die R. beide mit einem Komplex assoziiert, der drei unterschiedliche Polypeptidketten enthält: eine α-Kette mit R.-Aktivität, eine β-Kette mit Methylase-Aktivität und eine γ-Kette mit einer Erkennungsstelle für die DNA-Sequenz. Die Typ-I-Systeme benötigen S-Adenosyl-L-methionin und ATP für die R. – und die Methylase-Aktivität; sie sind wenig spezifisch und spalten wahrscheinlich zufällig an Stellen, die von der 5'-Seite der Erkennungsstelle weit entfernt liegen (1.000 Basenpaare). In Typ-II-Systemen liegen die Methylasen und R. getrennt vor; S-Adenosyl-L-methionin dient als Methyldonor, nimmt an der DNA-Spaltung jedoch nicht teil. Typ-II-Systeme benötigen kein ATP und sind hochspezifisch. R. spalten den DNA-Doppelstrang auf unterschiedliche Weise. Entweder sind die beiden Strangbrüche wie bei EcoRI (Tab.) gegeneinander versetzt, oder sie befinden sich wie bei Hae III an der gleichen Stelle. Im ersten Fall entstehen sog. sticky ends ("klebrige Enden"), die komplementär sind und miteinander hybridisieren können. Im zweiten Fall spricht man von blunt ends ("stumpfe Enden").

Restriktionsendonucleasen. Der Pfeil bezeichnet die jeweilige Spaltungsstelle, der Stern die Base, die durch Methylierung geschützt werden kann.