Restriktionsendonucleasen, Restriktionsenzyme, eine Gruppe von Hydrolasen, meist bakterieller Herkunft, die in beiden Strängen eines DNA-Moleküls Phosphodiester-Bindungen im Bereich definierter Basensequenzen (Erkennungssequenz) spalten (Endonuclease). Die entstehenden DNA-Spaltprodukte werden als DNA-Restriktionsfragmente bezeichnet.

Die Erkennungssequenzen sind meist 4 bis 8 Basenpaare (Bp) lang. Die Stellen, an denen die Phosphodiester-Bindungen innerhalb der DNA durch die R. gespalten werden, bezeichnet man als Spalt- oder Schnittstellen. Nach der DNA-Erkennungs- und Schnittstellensequenz unterscheidet man unterschiedliche Typen von R. Sie besitzen zum Teil neben der Endonuclease- noch Methylaseaktivität und erfordern außer Mg²⁺-Ionen – in Abhängigkeit vom R.-Typ – noch ATP und S-Adenosylmethionin als Cofaktoren.

Bisher sind mehrere Hundert unterschiedliche R. bekannt. Die Nomenklatur der R. leitet sich vom Namen des Mikroorganismus ab, aus dem die R. isoliert wurde, z. B. EcoR I: Escherichia coli, Stamm R. Werden mehrere R. aus dem Bakterienstamm isoliert, gibt die römische Ziffer die Reihenfolge an (z. B. Hind II, Hind III).

Die Funktion der R. in der Bakterienzelle besteht im Schutz vor eingedrungener Fremd-DNA (z. B. Viren, Plasmide). R. haben in der Gentechnik herausragende Bedeutung erlangt, da mit ihnen DNA-Moleküle in definierte Fragmente zerlegt werden können und sie auch essentiell für das Klonieren von DNA-Abschnitten sind.