Knöllchenbakterien, früher Bezeichnung für die schnell wachsenden Rhizobium- und die langsam wachsenden Bradyrhizobium-Arten, heute meist Name für Vertreter der Familie Rhizobiaceae und andere Bakterien in der α-Unterklasse der Proteobacteria (Rhizobiaceen-Bradyrhizobium-Gruppe), die an Pflanzen Knöllchen zur Fixierung von gasförmigem Stickstoff (N₂) bilden. Wichtige Gattungen sind Rhizobium (= Rhizobacterium = Phytomyxa), Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Photorhizobium (enthält Bakteriochlorophyll), Mesorhizobium, Allorhizobium (= Rhizobium), Azorhizobium. – Knöllchenbakterien sind ökonomisch und ökologisch wichtige Bodenbakterien (Bodenorganismen), die eine der wichtigsten, weit verbreiteten Symbiosen von Bakterien mit Pflanzen eingehen. Nach der Bildung von Wurzelknöllchen (Bakterienknöllchen) oder seltener Stengelknöllchen wird endosymbiontisch (Endosymbiose) in Hülsenfrüchtlern (Leguminosen) Luftstickstoff (N₂) fixiert. Knöllchenbakterien sind gramnegative Stäbchen (0,5–0,9 × 1–3 μm) mit unterschiedlicher Begeißelung; die Zellen können Ansätze von Verzweigungen oder andere unregelmäßige Formen aufweisen. Sie führen einen chemoorganotrophen Atmungsstoffwechsel (Chemoorganotrophie) aus, benötigen Sauerstoff (O₂), können aber sehr geringe Sauerstoffgehalte tolerieren. Als Substrate dienen verschiedene Zucker, Zuckeralkohole und Säuren. Knöllchenbakterien bevorzugen etwa neutrale und basische Böden (pH-Spanne ca. 4,5–9,5; Bodenreaktion), so daß eine Kalkung des Bodens ihre Anzahl erhöht. Weltweit ist die Symbiose der Knöllchenbakterien das wichtigste System der Stickstoffixierung. Die Knöllchenbakterien kommen von der subarktischen über die gemäßigte bis zur tropischen Klimazone vor. Stämme in gemäßigten Klimazonen haben meist ein sehr begrenztes Wirtsspektrum, in tropischen Gebieten ist die Symbiose nicht so spezifisch. Die große Bedeutung der Knöllchenbakterien liegt darin, daß sie stickstoffarme Böden verbessern, die Bodenfruchtbarkeit erhalten und in der Pflanzensymbiose zur Synthese von für Mensch und Tier wichtigen Proteinen beitragen, ohne daß eine kostspielige Stickstoff-Düngung (Dünger, Stickstoffdünger) notwendig wäre. Unter bestimmten Bedingungen können bis 250–600 kg N pro Hektar und Jahr gebunden werden (im Durchschnitt ca. 100 kg; Stickstoffkreislauf). Bei der Gründüngung wird bereits seit altersher die Fähigkeit der Bodenverbesserung durch Knöllchenbakterien ausgenutzt. Unter normalen Bedingungen können weder die Pflanzen noch die Bakterien allein Stickstoff fixieren. Experimentell kann auch mit freilebenden Rhizobium-Zellen unter besonderen mikroaerophilen Bedingungen eine Stickstoffixierung erhalten werden, so daß eine nicht-symbiontische Verwertung von Luftstickstoff in bestimmten natürlichen Habitaten möglich scheint. Die meisten Leguminosen können eine Symbiose mit bestimmten Arten bzw. Stämmen der Knöllchenbakterien eingehen, Nicht-Leguminosen dagegen nur ausnahmsweise, z.B. Parasponia. (In Nicht-Leguminosen, z.B. Erlen [Alnus], können aber auch Wurzelknöllchen gebildet werden; die stickstoffbindenden Symbionten sind in diesem Fall keine „echten" Knöllchenbakterien, sondern fädige Bakterien der Gattung Frankia [Frankiaceae].) Bestimmte Knöllchenbakterien-Arten (bzw. -Biovarietäten) sind in der Regel immer im Boden vorhanden, wenn die entsprechenden Wirtspflanzen angebaut werden ( ö vgl. Tab. ). Ihre Ausbreitung erfolgt mit Erde an Pflanzenteilen und Samen, durch Staub und Wasser. Nach Australien gelangten Sinorhizobium (Rhizobium) meliloti und Rhizobium leguminosarum biovar. trifolii durch europäische Einwanderer. Wenn Leguminosen (z.B. Sojabohnen) in Böden angebaut werden, wo spezifische Knöllchenbakterien fehlen oder „nicht-effektive" Stämme mit geringer Fähigkeit zur Stickstoffixierung vorliegen, kann durch eine künstliche Zugabe, eine Bodenimpfung oder Impfung des Samens, die Stickstoffixierung eingeleitet bzw. verbessert werden. Bereits 1895 (Nobbe und Hiltner) wurden in England und den USA Patente für Impfungen mit Leguminosenpräparaten (später „Nitragen" benannt) beantragt. Impfungen mit kommerziellen Knöllchenbakterien-Präparaten werden in vielen Ländern routinemäßig angewandt (z.B. Australien, Südafrika, ehemalige UdSSR). – Das Überdauern der geimpften Knöllchenbakterien ist abhängig von Wirtsvorkommen und der Bodenbeschaffenheit (z.B. Temperatur, Feuchtigkeit, Vorkommen von organischem Material) und dem Vorkommen von Antagonisten: vielen Bodenmikroorganismen (z.B. Protozoen, Myxobakterien, Bdellovibrio, Bakteriophagen). Manchmal müssen die Impfungen mehrere Jahre wiederholt werden, um eine ausreichende Population der Knöllchenbakterien im Boden zu erhalten. Durch Ausscheidungen der Wirtspflanze werden Knöllchen- und andere Wurzelbakterien im Wachstum gefördert. Die Knöllchensymbiose beginnt mit einem gegenseitigen Erkennen der Partner, der richtigen Pflanzenart und des geeigneten Bakterienstamms, ehe eine Anheftung der Bakterienzellen erfolgt. Das Erkennen des geeigneten Wirts erfolgt durch eine Wechselwirkung und spezifische Bindung von Oberflächenkomponenten der Pflanze (Lectine) und entsprechenden Verbindungen an der Oberfläche der Bakterien. Besonders wichtig für eine Anheftung sind noch spezifische Adhäsionsproteine, bei der Rhizobium-Symbiose z.B. das Rhicadhesin, ein Calciumbindendes Protein, das auch an der Oberfläche von Bradyrhizobium nachgewiesen wurde. Die chemotaktisch (Chemotaxis) angelockten Knöllchenbakterien heften sich an wachsende Wurzelhaare an ( ö vgl. Abb. 1a ) und scheiden sog. Nod-Faktoren (N-Acetylglucosamin mit verschiedenen Seitenketten; nod-Gene) aus, durch deren Wirkung sich die Wurzelhaarspitzen einkrümmen. Die Infektion und Invasion der Leguminosen durch die Knöllchenbakterien tritt meist an den Wurzelhaaren ein, kommt aber auch an der Wurzelbasis (Stylosanthes), den Seitenwurzelanlagen oder am Sproß vor. Durch die teilweise aufgelöste Zellwand in der Nähe der Wurzelhaarspitze dringen die Knöllchenbakterien in die Pflanze, z.B. Erbsen, ein und bilden einen sog. „Infektionsschlauch" (Bakterienschleimfaden; ö vgl. Abb. 1b ), der durch Teilung und Vergrößerung der Bakterien die jungen Zellwände der Epidermis und das Rindengewebe durchwächst. Der Bakterienfaden ist von Bakterienschleim umhüllt und durch Ausscheidungen von pflanzlichem Zellwandmaterial (Cellulose, Hemicellulose, Pektine) anfangs von den pflanzlichen Zellen abgegrenzt. Bevor der Infektionsschlauch in die Rindenzone eingewachsen ist, teilen sich bereits viele Rindenzellen, die Kerne vergrößern sich und werden vermutlich zum Teil polyploid. Diese Gewebewucherung (Wurzelknöllchenbildung) wird auch durch bakterielle Ausscheidung von Wuchsstoffen (Indolylessigsäure [Auxine], Cytokinine) mit verursacht. Die spezifischen Reaktionen bei der Knöllchenbildung bei den Rhizobium-Stämmen werden durch Faktoren ausgelöst, die von Nodulationsgenen (nod-Gene) codiert werden. Diese Gene befinden sich in der Bakterienzelle auf großen Plasmiden. Pflanzen-Flavonoide und -Isoflavonoide scheinen auch eine wichtige Rolle für die Induktion von bestimmten Nodulationsgenen und die Spezifität zwischen Pflanze und Bakterium zu spielen. Durch Verzweigung des Infektionsschlauchs kann die befallene Gewebezone verbreitert werden. An den Spitzen des Infektionsschlauchs werden die Bakterien schließlich in Rindenzellen freigesetzt. Sie liegen jedoch nicht frei im Cytoplasma, sondern sind von einer Membran umschlossen, die sich wahrscheinlich von der Cytoplasmamembran der Wirtszelle ableitet. In einigen Fällen können sich die Bakterien anschließend noch teilen, so daß (wirtsspezifisch) 1–2 bis 16 Bakterien membranumhüllt zusammenliegen, ehe die Umwandlung der stäbchenförmigen Zellen in unregelmäßige Formen (Bakteroide) erfolgt. Bakteroide können sich nicht mehr in der Wirtspflanze teilen. Das bakteriengefüllte Knöllchengewebe färbt sich durch das Hämprotein Leghämoglobin (Legoglobin) rot, dessen Proteinanteil (Globin) genetisch von der Pflanze und dessen Pigmentanteil (Protohäm) dagegen von den Bakterien stammt. Das Leghämoglobin liegt außerhalb der stickstoffbindenden Bakterienzelle. Es dient vor allem dem Sauerstofftransport zur Atmungskette der Bakteroide und könnte andererseits durch seine Sauerstoff-Bindungsfähigkeit die Konzentration an „freiem" Sauerstoff niedrig halten, so daß das N₂-bindende Enzym Nitrogenase ( ö vgl. Abb. 2 ) vor Oxidationen geschützt bleibt. Die membranumgebenen einzelnen Bakteroide bzw. die kleinen Gruppen zusammengeschlossener Bakteroide werden als Symbiosomen bezeichnet. Erst nach Auftreten der Bakteroide und von Leghämoglobin kann eine Stickstoffixierung festgestellt werden, und die parasitische Lebensweise der Bakterien geht in einen engen symbiontischen Stoffwechsel über, in dem die photosynthetische Kapazität der Pflanze mit der Fähigkeit der Bakterien, den Luftstickstoff zu verwerten, gekoppelt wird. Die Pflanze erhält ausreichend Stickstoff (oft ein begrenzender Wachstumsfaktor), und die Bakterien werden mit ausreichend Assimilationsprodukten (Zwischenprodukte des Citratzyklus, z.B. Succinat, Fumarat, Malat) von der Pflanze versorgt. Die Bakteroide sind in ihrer Substratversorgung zum Energiegewinn für die N₂-Fixierung vollständig von der Pflanze abhängig. Im Pflanzengewebe werden außerdem die Bedingungen geschaffen, die eine hohe Stickstoffixierung ermöglichen. Mit dem Altern der Pflanze verringert sich die Fixierungsrate und hört schließlich ganz auf; die Protoplasten der Knöllchenzellen und ein Teil der Bakterien sterben ab und werden resorbiert. Das Knöllchengewebe färbt sich durch Abbauprodukte des Leghämoglobins (Biliverdine) grün. Nach Absterben der Leguminosen gelangen die Knöllchenbakterien in größerer Anzahl in den Boden zurück, als bei der Infektion in die Pflanze eingedrungen waren, so daß auf diesem Umweg auch eine Vermehrung der Knöllchenbakterien im Boden eintritt. – Wirt und Knöllchenbakterien sind nicht nur in der Phase der Stickstoffixierung voneinander abhängig, sondern auf allen Stufen; von der Anheftung über die „kontrollierte" Infektion bis zur Aufrechterhaltung der Knöllchenfunktion beeinflussen sich, genetisch gesteuert, beide Partner gegenseitig. Die Gene für das stickstoffixierende Enzymsystem sind jedoch vollständig in den Bakterien lokalisiert. In den meisten Knöllchenbakterien sind diese nif-Gene sowie mindestens einige Gene, die für die Wurzelhaarinfektion und die Knöllchenbildung (Nodulation, nod-Gene) verantwortlich sind, auf großen Plasmiden (= Sym[biose]-Plasmide) lokalisiert. Die Sym-Plasmide können auf nicht-symbiontische Mutanten übertragen werden, die danach die Fähigkeit zu symbiontischer Stickstoffixierung wiedergewinnen. Einige chromosomale Gene der Bakterien sind gleichfalls für die Ausbildung der stickstoffixierenden Endosymbiose verantwortlich. Einige Knöllchenbakterien besitzen keine Sym-Plasmide; ihre nif-Gene sind auf dem Chromosom lokalisiert. – Auf die Möglichkeit, den Boden zu verbessern, hat bereits Theophrast (4. Jh. v.Chr.) hingewiesen. Experimentell zeigte J.B. Boussingault (1838), daß Klee den Stickstoffgehalt des Bodens erhöht, daß bei Wachstum in ausgeglühtem Sand jedoch keine Wirkung zu erkennen ist. Schulz-Lupitz baute Leguminosen als Stickstoffsammler in stickstoffarmen, leichten Böden an. 1888 zeigten dann H. Hellriegel und H. Wilfarth, daß die Stickstoffbindung der Leguminosen an die Lebenstätigkeit von Bakterien in den Wurzelknöllchen gebunden ist. Im gleichen Jahre gelang M.W. Beijerinck die Reinkultur dieser Bakterien aus Wurzelknöllchen, die er Bacillus radicicola nannte (heute: Rhizobium leguminosarum). 1890 beschrieb A. Prazmowski den Infektionsverlauf. In Isotopenversuchen mit ¹⁵N₂ wiesen P.W. Wilson und Mitarbeiter (1942) nach, daß die Stickstoffixierung tatsächlich im Wurzelknöllchengewebe erfolgt. – Knöllchenbakterien und ihre Symbiose werden heute auf der ganzen Welt in vielen Forschungsvorhaben untersucht. Fernziel der Gentechnologie ist es, die in der Natur fast ausschließlich auf Leguminosen beschränkte Symbiose auf andere landwirtschaftlich wichtige Pflanzen (transgene Pflanzen) auszuweiten. ö Knöllchenbakterien .

G.S.

Knöllchenbakterien

Abb. 1: a Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines an einem Wurzelhaar einer Gartenerbse haftenden Knöllchenbakteriums. b Mikroskopische Aufnahme des symbiontischen Bereichs eines Wurzelknöllchens der Luzerne (Medicago sativa). B Bakteroide (hier Rhizobium meliloti), IS Infektionsschlauch, S Stärke, V Vakuole, Z Zellkern.

Knöllchenbakterien

Abb. 2: Schematische Darstellung der N₂-Fixierung und des Transports einiger Stoffwechselprodukte zwischen Pflanzen- und Bakterienzelle (Rhizobium leguminosarum) in den Wurzelknöllchen. Der Luftstickstoff (N₂) wird durch die Bakterien zu Ammoniak (NH₃) reduziert, das in die Pflanzenzelle gelangt und zu Glutamin und Asparagin oder Ureiden (Allantoin, Allantoinsäure) assimiliert und in dieser Form transportiert wird. (ETK = Elektronentransportkette der Atmung, Lh = Leghämoglobin).